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冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂,将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程,大大缩短了制片时间。同时,由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,并作为快速切片的方法应用在临床诊断。取材:应尽可能快地采取新鲜的材料,防止组织发生死后变化。速冻:为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要,一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻,使组织温度骤降,缩短降温的时间,减少冰晶的形成。液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后,即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80冰箱贮存备用。)切片:恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,其基本结构是将切片机置于低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至5-10μm。切片时,低温室内温度以-15~-20为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。30min后,入4℃丙酮固定5~10min,烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。进行抗原热修复,微波热修复也可,室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10min,消除内源性过氧化物酶的活性。
5.免疫荧光染色:
冰冻切片室温晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时(此步可不洗)
滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,孵育2小时或4过夜。PBS冲洗孵育×3次μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶,用处理干净的盖玻片封片,即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。做好的片放在切片盒内,置于4℃冰箱,可保存一周左右。
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