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京尼平的制备、纯化及应用 Preparation of genipin,purification and application 主 要 内 容 1.项目背景 2.实验仪器与材料 3.实验原理与方法 4.实验结果分析 1.1 京尼平的特性及应用 京尼平（genipin）来源于茜草科植物栀子，它是一种环烯醚萜类的白色化合物 。 京尼平能与壳聚糖发生交联反应产生稳定的结构，且京尼平交联壳聚糖水凝胶已广泛用于制作生物医学材料 。 京尼平作为水溶性天然交联剂，能与蛋白质或氨基酸发生反应，产生深蓝色物质。 京尼平能与氨基酸反应，可以用于生产栀子蓝色素 。 京尼平是一种天然生物交联剂。大量研究表明，京尼平可以用于组织工程领域制备人工血管、人工神经导管、人工黏合骨组织颗粒、人造生物瓣膜、生物补片等，临床实验表明，京尼平有优良的生物相容性，效果显著优于传统的合成交联剂，并且对原组织的功能恢复有促进作用。 京尼平在医药生产方面也具有很高的价值，特别是在治疗II型糖尿病方面，相比其它合成药物更加天然、有效，且对身体副作用小。 2 仪器与材料 实验仪器 LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津） 、 UV1600紫外/可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司) 、酸度计（上海雷磁） 、电子天平（梅特勒托利多） 、 LRH-150-Z恒温振荡培养箱（广东医疗器械厂） 、旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司） 、 Olympus CX41显微摄像系统（厦门叁诺西努电子科技有限公司）。 实验材料 黑曲霉（中科院）、 98%栀子苷（临川之信生物科技有限公司）、98%京尼平（临川之信生物科技有限公司）、黑曲霉（中科院）、pda培养基、海藻酸钠（上海国药试剂）、戊二醛、明胶 、乙酸、氢氧化钠、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚 等 大孔树脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD700（沧州宝恩化工）；大孔树脂HZ201、HZ801、802、803（上海华震科技贸易公司） 氨基酸: Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val（上海源聚生物科技有限公司） 3 实验原理与方法 实验原理： 京尼平（Genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物。因此，我们以高纯度栀子苷为原料，采用β-葡萄糖苷酶对其进行水解（原理见图）。 由于京尼平分子中隐含有独特的戊二醛结构，可以与伯氨基化合物发生反应生成蓝色化合物（反应机理见图),所以可以利用氨基酸与京尼平在特定条件反应制备栀子蓝色素。 实验方法： 1.采用液体发酵法培养黑曲霉，再利用包埋法制备固定化酶 2.采用酶水解法制得京尼平 3.采用柱层析和结晶纯化京尼平 4.采用京尼平与氨基酸反应制备栀子蓝色素 5.采用京尼平交联制备固定化酶 4 实验内容 1.共固定化β-葡萄糖苷酶的制备条件及酶学性质研的究 2.固定化酶制备京尼平及其条件的优化实验； 3.京尼平纯化条件优化实验 ； 4.京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素的条件探索实验 ； 5 .栀子蓝色素稳定性实验； 6.京尼平与戊二醛作为交联剂制备固定化酶的对比实验； 4.1共固定化β-葡萄糖苷酶的制备条件及酶学性质研的究 β-葡萄糖苷酶和菌丝共固定化条件的优化 明胶戊二醛交联、海藻酸钠包埋法固定化酶实验中，对酶活性回收率影响较大的因素主要有戊二醛质量分数、交联温度以及交联时间3个方面，本实验对上述3个因素进行了优化 共固定化β-葡萄糖苷酶和菌丝的酶学性质 1、共固定化酶的最适温度在30℃-70℃范围内，按1.2.4分别测定不同温度下溶液酶和共固定化酶的酶活。 2 、共固定化酶的最适pH 按方法1.2.3，将溶液酶和共固条定化酶分别在pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的乙酸-乙酸钠缓冲液中测定酶活力. 4.2 固定化酶制备京尼平及其条件的探索及优化实验 1、取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml， pH调到7，分别在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、80℃水解，反应2h取样稀释适当的倍数检测转化率。 2、取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，由3.3.1的最佳条温度，pH分别为4、5、6、7、8、9，反应2h取样稀释适当的倍数检测转化率。 3、取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，在2.3．2的最佳pH和3.3.1的最佳条温度的条件下水解，每隔一个小时取一次样，取样稀释适当的倍数检测转化率。 4.3 京尼平纯化条件探索及优化