定量PCR方法及数据分析.ppt

定量PCR原理、应用及数据分析 ZJW 原理： PCR（多聚酶链式反应)：一种体外扩增特异DNA片段的技术。反应分为变性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（extension）三步。 PCR扩增理论方程： 起点定量与终点定量： 起点的DNA量为“天然”的含量，更有意义；终点的DNA量为经过PCR过程 “加工”的量，存在部分“失真”。（终点定量存在更大的误差） 定量PCR：通过实时监测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量或者定性的分析 化学原理：荧光染料嵌合法, 探针法 SYBR Green I（不饱和型），Eva Green / LC Green（饱和型），与dsDNA小沟部位嵌合，具有绿色激发波长。游离时不发光。 缺点：需用melting curve检测产物特异性。 探针法：可用于多重PCR及基因分型 TaqMan 探针：检测积累荧光 一种寡核苷酸探针, 探针两端各锚定一个基团，淬灭剂则在3‘末端。 Taqman探针识别并结合特定的靶序列； 探针完整时，报告基团R发出的荧光被淬灭基团Q吸收； 在进行延伸反应时,Taq聚合酶的 5’外切酶活性将探针切断, 使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。 基线：扩增曲线中的水平部分 阈值（Threshold):指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。 Ct值：从基数到指数增长的拐点所对应的循环次数 定量PCR数学原理 定量PCR技术的应用 定性分析：病毒病原菌检测、生物品种鉴定、SNP分析等、基因突变分析等 绝对定量：基因拷贝数分析，病毒病原菌定量分析等 相对定量：mRNA表达分析，siRNA表达分析等 定量PCR实验流程 目标基因的查找、比对 引物、探针的设计与合成 反应体系和条件的优化 数据分析 定量PCR引物设计的要求： ① Tm=55-65℃ ② GC=30-80% ③ PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-300bp 之间都可。 ④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。 内参基因的选择： 内参：用于去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率差异对目标基因表达的影响。 稳定表达于不同类型的组织和细胞中（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量无显著差异； 高度或中度表达，排除太高或太低表达； 表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关，且不受任何外源性和内源性因素的影响。 常见几种内参基因的优缺点： GAPDH：在不同癌组织（包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌）中表达升高，在不同个体间、妊娠期间以及细胞周期的不同阶段，以及多种因素刺激下（包括低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等）表达存在差异； β-actin：细胞恶性转化时表达水平增加； 18S rRNA: rRNA合成的调节独立于mRNA。rRNA不包括Poly A尾，在以Oligo dT作为引物的cDNA合成中不能被转录。rRNA高丰度表达，远高于目标基因，较其他内参基因稳定，且受RNA降解的影响比较小。 反应体系的配制 （25ul体系） 组分 加量 模板cDNA 2uL 10uM引物F/R 各0.5uL 2x SYBR Green mix 12.5uL ddH2O 9.5uL 熔解曲线 绝对定量：从荧光强度到拷贝数 相对定量的数据分析(2-ΔΔCt法/comparative Ct method) Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. 目标基因表达量（处理组/非处理组）的差异 Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-