2010猪血清白蛋白的分.ppt

猪血清白蛋白的分离、纯化与鉴定;血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总量的60％。 它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。 此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛 。 ;实验目的;原理与操作;一、血清白蛋白的分离;收集血清： 取2 mL血液，4 ℃，3,000 rpm 　离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管；留0.1mL（样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳.;盐析：中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。 中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。 分级盐析实现蛋白质的分离纯化。 在血清中加入硫酸铵，当饱和度为50%时，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达55%，白蛋白析出。 ;量筒量取9 ml底液（50 %的饱和硫酸铵溶液），用移液管逐滴加入，不断摇晃。4 ℃静置2 h； 4 ℃，13,000 rpm离心20 min，收集上清，留0.5 ml（样2）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳； ;用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积（0.11×V）； 逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），振荡，4 ℃静置2 h； 4 ℃，１3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存在；留0.1 ml（样3）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳； NH4＋的检测：奈氏试剂;奈氏反应 ;二、血清白蛋白的纯化;在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间的静电吸引。 蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度或pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。 本实验采用的DEAE－纤维素离子交换剂.;层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改变（??度洗脱），另一种是渐进式的连续改变（连续洗脱）。;除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析柱上，在此pH 时，DEAE -纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清白蛋白等电点为4 . 9 ，绝大多数。α及β球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。 ;DEAE-纤维素离子交换层析： 装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜； 洗脱液流速调节为 1mL/min； 上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内； 洗脱：采用连续梯度洗脱，用0.02～1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行洗脱，收集； 记录出现峰值的管号(样品4,…) 洗脱速度慢，可直接换B液（ 1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液）;五、血清白蛋白的相对分子质量测定 --SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态；2.复合物都是椭圆棒状。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。;测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMW为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量．;在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-Bx（MW为分子量，X为迁移率，k、B均为常数） 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 ;计算猪血白蛋白的分子量 ：logMW=K-Bx;胶的制备;样品的处理 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min，取出冷至室温。 上样顺序：①标准蛋白；②样品1；③样品2；④样品3；⑤柱层析