WB基础知识.ppt

实例分析 SDS PAGE One Step Western Kit (Rabbit)一步法快速WB试剂盒（兔源） CW2029 One Step Western Kit (Mouse)一步法快速WB试剂盒（鼠源） CW2028 节省常规WB的封闭、一抗孵育、漂洗、二抗孵育的过程 GoldCassette-HIS HIS 重组标签蛋白快速检测试剂盒 CW2005 GoldCassette-GST GST 重组标签蛋白快速检测试剂盒 CW2007 实验过程中不需要进行SDS和WB，即可判断基因是否得到表达。本产品尤其适用于重组蛋白表达工程菌和转染细胞的初筛(最低可检测到的融合蛋白浓度为10 ng/ml) 信号弱或无信号 封 闭 去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h. 抗体孵育 一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体 二抗的选择 HRP，AP，生物素，荧光素，罗丹明标记 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获 得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数. MMP-9 抗MMP-9的兔单克隆抗体（注意说明书上的应用种属和实验） 抗MMP-9的鼠单克隆抗体 抗MMP-9的兔多克隆抗体 HRP（辣根过氧化酶) AP（碱性磷酸酶） 大小 40kD 140kD 最佳酶活性 PH：5－7 PH：8－10 酶活和二抗特异性 好于AP 抑制剂 氰化物， 硫化物 叠氮钠 氰化物， 砷酸盐，有机磷， 二价阳离子螯合剂 稳定性 零度以下稳定 零度以下不稳定 底物 很多 部分 动力学特性 快速 慢 价格 便宜 昂贵 发光底物 ECL 显色底物 TMB，CN，DAB NBT，BCIP，NBT/BCIP 两种常用检测酶系统的比较 一抗（抗β-actin兔多抗） WB： 1:1000-1:4000稀释 二抗（山羊抗兔HRP） WB：1:2000-1:10000稀释 显色或发光 5 检测方法 化学显色法 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 康为世纪化学发光底物特点 高灵敏度：比显色法高103-106倍 灵敏度选择（普通型10-11g ,增强型pg级别） 节约抗体:其它底物用量1/10－1/1000 强信号，长发光，8－24小时 底物稳定，常温保存 检测快速：1-5分钟 高特异性，高信/噪比 检测方便： X光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度 CW0048 CW0049 特别推荐：不需反复作WB的选择 Stripping buffer CW0056 无须反复电泳和转膜，节省宝贵时间 节省珍贵的样品 在不损伤蛋白的基础上，剥离一抗和二抗 一份样品，一次电泳，一次转膜，多次印迹，更多数据 45K Beta-actin 45K 35K GAPDH 高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快 Western荧光检测取决： 抗原含量 转膜效率 一抗敏感度 二抗敏感度 底物敏感度 显影、定影效率 Western Blot定义 Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相 载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 Fc Fab Ag 抗体是机体针对外界抗原产生的一种免疫球蛋白 抗体可以特异性的识别并结合相应抗原 Western Blot基于抗原与抗体特异性结合原理 Western Blot基本原理 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究 Western Blot应用 Western Blot 主要步骤 蛋白样品制备 SDS转膜 抗体检测 显色或发光 蛋白样品制备 1 蛋白抽提的基本方法 物理方法 反复冻融 机械搅拌 超声 研磨 酶解法 化学方法 自溶法 洗涤剂 总蛋白的提取 细胞