Westernblot实验步骤.ppt

Western blot（免疫印迹） Western blot是20世纪70年代末和80年代初，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的一种广泛应用于蛋白质检测的分子生物学技术。它是将蛋白质凝胶电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术。与Southern、Northern杂交方法类似，但Western Blot被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，它具有直观、特异、灵敏（pg)的优点，且可进行蛋白质的定性及半定量分析。  Western blot实验原理： 蛋白质混合样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带（其中含有能与特异性抗体相应的待检测的蛋白即抗原蛋白）原位转移到固相载体膜上（蛋白条带转移到NC、PVDF膜上此过程称为blotting ），用无关蛋白质封闭液（如BSA）封闭膜的非特异性位点（膜上没有蛋白转移上去的位点），加入特异性抗体（即一抗，是抗目的蛋白的抗体）后印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗发生特异性的免疫结合反应，洗涤后再加入能与一抗发生免疫结合反应的酶标记二抗(二抗即抗抗体，是以一抗为抗原免疫动物产生的抗体)，最后通过二抗上标记酶的性质进行检测，即根据底物显色的颜色有无及深浅（或发光有无及发光强弱）来探测膜上印迹蛋白抗原的存在与否及含量多少。 Western blot 实验步骤 1.蛋白样品的制备 2. SDS蛋白电泳 3. 转膜 4. 封闭 5. 一抗反应 6. 洗膜 7. 二抗反应 8. 洗膜 9. 底物显色或发光 10. 终止反应,并照片记录结果 标记二抗的酶 1.辣根过氧化合酶（HRP），来源于植物，用于动物性样品的检测（目的是消除样品中内源性酶的干扰，降低背景）。 2.碱性磷酸酶，来源于动物牛小肠（目前也有细菌表达的产物），用于植物性样品的检测，（目的是消除样品中内源性酶的干扰，降低背景）。 用于免疫印迹的膜及其预处理 硝酸纤维素膜（NC 膜）的预处理：转移缓冲液湿润膜； 硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力地结合在一起。 从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，最大的蛋白结合量可达80-150μg/cm2。 硝酸纤维素膜很脆，易破。 根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1μm，蛋白的转移就很难进行了。因此，通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生转移到膜反面或穿过膜的现象。 PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合； PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品； 带正电的尼龙膜(目前已不用)； 蛋白结合于膜的作用力为非共价键的疏水力、静电力 硝酸纤维素膜是通过疏水作用与蛋白质结合，而PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和负电荷的蛋白结合，同时也有疏水作用，因而，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落。 SDS中SDS（十二烷基硫酸钠）的作用 强阴离子去污剂使蛋白质变性、亚基解离：SDS打开蛋白质中半胱氨酸残基之间的二硫键, 破坏蛋白质的四级结构, 它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构； 带负电荷的SDS覆盖于蛋白质表面，把蛋白质本身的电荷封闭，并使蛋白质表面带负电荷，从而使蛋白质在电泳时向正极移动； SDS与多肽结合的量与多肽的分子量成正比而与其序列无关（平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子），因此SDS-多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽分子量大小相关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）原理 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）是蛋白质分析过程中最常用的技术。 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS将包裹