抗原与抗体反应-免疫检测实验原理和方法.ppt

第三节 抗原与抗体反应-免疫检测法 抗原与抗体结合后，只有出现可见的反应，如凝集、溶血、沉淀实验等，或用荧光素、酶、放射性同位素等标记方法提高可测性，才便于在免疫检测中运用。可见性反应的出现，对抗原抗体分子合适比例的要求远比对彼此绝对量方面要高得多。这就是说，一方面在进行免疫检测时要注意抗原抗体的用量；另一方面只要提高可见度或可测性，便可大大提高免疫检测方法的灵敏度。 一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。 二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成沉淀。 1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。 2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，37度保温10-20min，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。 3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。 沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。 双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。 抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。 4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量 另外还有其他众多的免疫检测技术和手段，其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。只不过其检测的对象和检测的目的各有不同。 三、补体结合试验 当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结合并形成抗原抗体复合物后，可结合补体引起溶菌、溶血效应。用补体结合试验既可以测知患者血清中补体的总量，也可以检测未知抗原或抗体的量。 测定人血清补体总量的方法是以绵羊红血球的溶血为指示。当绵羊红血球与抗绵羊红血球结合后，加患者血清，观测溶血程度。 用于测定未知抗原/抗体时，采用两套系统，一套是待测的抗原抗体系统，称为检测系统，一套是包括绵羊红血球和抗绵羊红血球抗体的指示系统。待测系统中有无待测得抗原/抗体是利用指示系统中是否出现溶血来判断。 反应的过程是首先加待测得抗原/抗体，反应一段时间后加入补体，在反应一段时间后加指示系统。有待测抗原抗体结合时，必然结合补体，不会出现溶血，没有待测物质时出现溶血。 四、荧光抗体技术 免疫荧光法是将荧光素与特异性血清抗体以化学方式结合起来，然后将此荧光标记了的抗体作为一种试剂在特定条件下浸染标本，使与标本中相应的抗原产生结合反应，再在荧光显微镜下，以紫外光为光源进行观察。当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。 免疫荧光法有直接法和间接法两种。 第四节 免疫亲和层析 生物高分子具有能和某种相对应的专一分子可逆结合的特性，例如酶的活性中心或别构中心能和专一的底物、抑制剂、辅助因子效应剂通过某些次级键相结合，并在一定条件下又可以解离。抗体与抗原，激素及其受体，核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有类似的特性。这种高分子和配基之间形成专一的可解离的复合物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析就称为亲和层析。 亲和层析法的基本过程： 1、偶联：将欲分离的高分子物质的配基在不影响其生物功能的情况下与水不相溶性的载体结合，制成亲和吸附剂或免疫吸附剂。 2、装柱：在层析柱内装入固相化的配基 3、亲和层析：含有高分子物质的混合液在有利于配基和高分子之间形成复合物的条件下进入装有亲和吸附剂的层析柱。高分子物质结合留在柱内，其他杂质流出。 4、洗脱：改