第二讲细胞工程.ppt

第二章 细胞工程 第一节 概述 1.细胞工程的应用 紫杉醇、动物蛋白、干细胞、组织培养 2.细胞工程与基因工程的区别 细胞工程：从整体动物或植物上分离得到细胞，然后将细胞在反应器中进行目的产品的生产 基因工程：将细胞进行修饰（整合目的基因）再发育成动植物整体或组织，然后以该整体或部分为反应器生产目的产品。 第二节 细胞的基本概念 1. 细胞是生命活动的基本单位 细胞是构成有机体的基本单位 细胞是代谢与功能的基本单位：细胞具有独立的、有序的自控代谢体系 细胞是有机体生长发育的基础：有机体生长是以细胞增殖与分化为基础的 细胞具有遗传的全能性：单个的植物生殖细胞或单个体细胞、未受精的两栖类动物卵细胞可经处理发育成完整的个体 2.细胞的基本共性 所有细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜 所有细胞都有两种核酸：DNA和RNA 都有核糖体 所有细胞增殖都以一分为二的方式进行分裂 3. 细胞生物学的研究方法 3.1 细胞形态结构的观察方法 3.1.1光学显微技术 光学显微镜的分辨率受到介质折射率和光波长的影响 普通光学显微镜 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一 激光共聚焦扫描显微镜 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量，其原理是利用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍 相差显微镜和微分干涉显微镜 3.2.2 电子显微镜 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成，图 3.2.2.1 制片技术 1）超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差，图 2）负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右，图 3）冰冻蚀刻 冰冻蚀刻又称冰冻断裂。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构，图 3.2.3 扫描电子显微镜 扫描电子显微镜用来观察标本的表面结构。其原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号 ，图 3.2.4 扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压，针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 3.2.5 显微操作技术 显微操作技术是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，图 4.细胞的基本结构 4.1细胞的基本结构 细胞壁的结构 细胞膜的结构 细胞膜具有极性头部和非极性尾部的磷脂分子；蛋