仪器分析高效液相色谱.ppt

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仪器分析高效液相色谱重点讲义

按固定相的聚集状态分类: 液-固色谱法 液-液色谱法 按分离机制分类: 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法 其它分离机制色谱法: 亲合色谱法 AC 胶束色谱法 MC 手性色谱法 CC 毛细管电色谱法 CEC 第六节 毛细管电泳法 Capillary Electrophoresis 1、毛细管区带电泳 CZE 2、毛细管凝胶电泳 CGE 3、 胶束电动毛细管色谱(MECC ,MEKC) 例:毛细管电泳(抑肽酶) sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图 原理:不同待测离子对固定相亲和力的差别 固定相: 基质:合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶 表面键合离子:阳离子和阴离子交换树脂 四、离子交换色谱法(IEC) 流动相:一定pH和盐浓度的缓冲溶液 用途:适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 离子对AB具有疏水性,被非极性固定相提取 不同待测离子A1,A2…与B离子间成对能力不同,形成不同疏水性离子对,从而保留值不同 原理:将与待测物离子A电荷相反的离子B加入到流动相中形成离子对AB,间接改变待测离子保留特性 五、离子对色谱法(IPC) 如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液 用途:主要用来分离强极性有机酸和有机碱 固定相: 化学惰性的多孔性材料,如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相: 作用不是为了控制分离,而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 六、尺寸排阻色谱法(SEC) 常用流动相 ——四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水 原理:利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。 凝胶过滤色谱: 以水或缓冲液作流动相 主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱: 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离 用途 六、尺寸排阻色谱法(SEC) 特点: 固定相与分子间作用力趋于零,柱寿命长 相对分子质量差别必须大于10%才能分离 七、亲和色谱法(AC) 原理:利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力,进行选择性分离 固定相:生物专一性配基+载体 流动相:一定pH的缓冲液 具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留;没有亲和力作用的分子不被保留。 用途: 蛋白、酶、抗体分离,生物和医药分析 第四节 HPLC分离条件的选择 根据van Deemter方程和色谱分离方程式选择分析条件 在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,而只有两项,即: H = A + C u (1)固定相: ①粒度小,均匀,以减小涡流扩散和流动相传质阻力; ②改进结构,采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体,减少滞留流动相传质阻力。 第四节 HPLC分离条件的选择 (2)流动相: 低粘度的流动相——增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm——减少传质阻力 (3)流速: 最佳流速在流速很小处,减小流速有利提高柱效 常采用比最佳流速高数倍的流速——加快分析速度 第四节 HPLC分离条件的选择 (4)柱温: 提高柱温——降低流动相粘度——减少传质阻力——分辨率降低,柱寿命短,易产生气泡, 一般在室温下进行 第四节 HPLC分离条件的选择 第五节 HPLC的建立与应用 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。 材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱:柱的规格(柱内径及柱长)和选用固定相(粒径及孔径) 流动相 检测器 样品预处理 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化 流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 二、HPLC定性定量分析方法 1、定性分析 色谱鉴定法:保留时间对照 化学鉴定法:利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性 色谱-光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法: 色谱光谱联用仪 二、HPLC定性定量分析方法 2、定量分析 外标法:外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等 不需知道校正因子,但需进样量准确 内标法:内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法 1、在食品分析中的应用 食品营养成分分析:蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等; 食品添加剂分析:甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等; 食品污染物分析:霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。

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