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感受态细胞转化操作步骤128
感受态细胞转化
(一)实验准备:
1.Amp母液:
称取氨苄青霉素100mg溶于1ml dd H2O中。0.22μm滤器过滤除菌,用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
2.X-Gal溶液(2%,m/v)
称取20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺(DMF)中。用玻璃试管或聚丙烯管分装后储存于-20℃冰箱,装有X-Gal溶液的试管须用铝箔包裹以防因光照而被破坏.(无须过滤)
3.IPTG(20%,m/v,0.8mol/L)
称取IPTG2g溶于8ml dd H2O中。用蒸馏水定容至10mL。0.22μm滤器过滤除菌,用EP管分装成1mL一小份后储存于-20℃冰箱.
(二)操作步骤“
质粒pBS SK(-)的转化
1.取感受态细胞置于冰浴中,待感受态细胞融化后,分别在100μl感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水,轻轻摇匀后冰上放置30分钟。
??感受态细胞+pBS SK(-)质粒2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl)
??感受态细胞+无菌水2μl (阴性对照)
2. 热击:42℃水浴中热击90秒(注:精确计算时间,过长将对细胞造成伤害),热击后立即置于冰上冷2-5分钟(禁止摇动)。
3. 复苏:向每管中加入400μl LB液体培养基(注:不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
涂布平板筛选转化质粒
方法一(《分子克隆实验指南》标准方法)
将溶化的顶层琼脂分装于17*100mm试管,将试管置于45℃的加热块槽内备用。
(90mm培养板用3mL顶层琼脂;150mm培养板用7mL顶层琼脂)
2.从加热块取出一支试管,快速加入活菌含量不多于3000(90培养基)或10000(150培养基)的细菌悬液0.1mL。盖紧试管盖颠倒数次。以使细菌在琼脂中混匀。
3.按下表加入:
培养板
尺寸 试剂用量 溶化态顶层琼脂 X-Gal IPTG(如果需要) 90mm 3mL 40ul 7ul 150mm 7 mL 100ul 20ul 4. 快速将溶化的顶层琼脂倾入含有适当抗生素的凝固琼脂板的中部,旋转培养板使琼脂散匀。
.注:含Amp的LB固体培养基倒板
(1)配制:100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
(2)抗生素的加入:高压灭菌后,应使培养基降温至50℃,方可加入Amp,按每100ml培养基加10mg/ml Amp溶液1ml,使其终浓度为100μg/ml(但是也有人认为Amp浓度为50—100ug/ml),
(3)倒板:在超净台上铺平板,90mm直径的培养皿约需25ml培养基。培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照10-15分钟。
5.于室温使琼脂凝固,擦净培养板盖上的冷凝水,颠倒培养板于37℃培养12-16h.
6.取出培养板于4℃放置数小时使菌落显色。
7.鉴定携带重组质粒的克隆
1).携带野生型质粒的克隆含有β-半乳糖苷酶活性,菌落的中央呈淡蓝色,外周成蓝色。
2). 携带重组质粒的克隆含有β-半乳糖苷酶活性,菌落呈奶白色,有时会在菌落中央出现假性蓝斑.
8.筛选和培养携带重组质粒克隆.
软琼脂中蓝色或白色克隆可在不同方向上形成,不管其方向性,这些克隆很容易用接种环或牙签通过穿刺琼脂浅层而被挑选出来,并转移至含有抗生素的培养基中.
方法二(《分子克隆实验指南》备用方法)
1在含有适当抗生素的预制90mm琼脂板(LB或YI)中央滴加40uL2%X-Gal和7uL20%IPTG(如有必要)
2.用一个无菌的涂布器(或一个弯曲而顶口已用火焰封闭的巴斯德吸头)播洒X-Gal溶液,使之分散于培养板表面。于37℃温浴至全部液体消失。
(由于二甲基甲酰胺的挥发性低,如用新鲜琼脂板这一过程要持续3-4h。)
3接种需要鉴定的细菌,可以用接种环划线,也可以用牙签挑取克隆,或用细菌悬液(50000个细胞/mL)铺板,90mm板用100ul悬液。
4.颠倒培养板于37℃培养12-16h.
5.取出培养板于4℃放置数小时使菌落显色。
方法三
IPTG,X-Gal,AMP培养基
1.在100ml的琼脂培养基中,加入200ulX-Gal(2%),100ul的Amp和100ulIPTG(20%),制成培养基。
2.倒板后打开盖子,在紫外下照10-15分钟。
3. 接种需要鉴定的细菌,可以用接种环划线,也可以用牙签挑取克隆,或用细菌悬液(50000个细胞/mL)铺板,90mm板用100ul悬液。
4.颠倒培养板于37℃培养12-16h.
5.取出培养板于4℃放置数小时使菌落显色。
次日(12-14小时后)观察和计算转化率:观察记录转化情况并统计转化率。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
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