annealing 第十四章核酸的物理化学性质.PPT

主要内容：主要介绍核酸的水解、核酸的酸碱性质、核酸的紫外吸收性质、核酸的变性、复性及杂交。 一、核酸的水解 一、核酸的水解 一、核酸的水解 (三) 酶水解 1.核酸水解酶的分类 (1)按底物的专一性分类 核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase） (2)作用方式 核酸内切酶（endonuclease） 核酸外切酶（exonuclease） (3)按磷酸二酯键断裂的方式 (4)其它 如双链酶、单链酶等 2.核糖核酸酶类 (1)牛胰核糖核酸酶 （pancreatic ribonuclease, 简称RNase A或RNase I） (2)核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称RNase T1）  (3)核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2） 主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC 3.脱氧核糖核酸酶 (1)牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I） (2)牛脾脱氧核糖核酸酶  （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II） (3)限制性内切酶（restriction endonuclease）   简称限制酶 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。 限制性内切酶的特征 ① 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 ② 粘性末端，平整末端 限制性内切酶的命名 EcoRI E为大肠杆菌E.coli属名的第一个字母， 第2、3个字母co为它种名的头两个字母， 第四个R表示所用大肠杆菌的菌株， 最后一个罗马字表示该菌中已分离出的这一类酶的编号。 HindⅢ 流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d） 限制性内切酶举例 二、核酸的性质 （一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。 分子大小：DNA Mr 106～1010或更大 RNA Mr 104～106或更大 性状：DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。 核苷酸的两性解离和等电点 胞嘧啶核苷酸的解离 （三）紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。 1．紫外分光光度法 首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度 纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低） 纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量 若260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA 或相当于40μg/ml单链DNA或RNA 或相当于20μg/ml寡核苷酸。 2．摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法 3．增色效应与减色效应 增色效应（hyperchromic effect） 减色效应（hypochromic effect） 三、核酸的变性、复性及杂交 1．变性（denaturation） 核酸变性的概念 核酸的双螺旋区的氢链断裂变成单链，不涉及共价键的断裂。 引起核酸变性的因素： 　　　热变性、甲醛（Agar）和尿素（PAGE）等。 （1）热变性 结构：螺旋→线团 理化性质：紫外吸收↑ 粘度↓ 其中DNA变性为爆发式， 发生在很窄的温度范围内 （2）熔点（Tm） Tm: 熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度 （3）影响Tm值的因素 ① DNA的均一性 ② DNA中G-C对的含量 经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44 ③ 盐离子强度 盐低易变性 盐高不易变性 2．复性（renaturation） （1）复性 理化性质: ε(p)↓ 比旋光度↑ 粘度↑ 生物活性得到部分恢复 （2）影响复性的因素 ① 样品的性质 ② DNA的浓度 ③ DNA片段的大小 ④