ZFN（锌指核酸酶）.PDF

ZFN （锌指核酸酶） 1.什么是锌指核酸酶 锌指核糖核酸酶（ZFNs） 由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2 锌指蛋白（Zinc-fingers）串联组成（一般 3-4 个），每个 锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcrip tion factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta 二级 结构。单个锌指的alpha 螺旋插入DNA 双螺旋的大沟, 特异性识别DNA 序列上3 个连续碱 基, 并与之结合. 从A 螺旋开始的- 1、2、3、6 相应位置的氨基酸残基与DNA 相互作用, 形成对位点识别的特异性。 图一 锌指的空间结构 现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的 GNN 和ANN 以及部分CNN 和TNN 三联体。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白 组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计锌指核酸酶 （ZFNs ）。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI 的C 端的96 个氨基酸残基组 成的DNA 剪切域(Kim et al., 1996)。FokI 是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚 体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个 FokI 单体与一个锌指蛋白组相连构成一个 ZFN ，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6-8 bp ），两个单体ZFN 相互作 用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。 图2 ZFNs 识别结合特异序列示意图 2.锌指核酸酶有什么用 ZFNs 有助于建立完整的基因knockout 和knock-in 体细胞，胚胎细胞，原代细胞系， 从而使研究者能更精确鉴定基因的生物功能。ZFN 介导的基因组编辑，有望用于产生新的能 更接近地模仿人类疾病的疾病动物模型，以及为新的药物化合物潜在毒性提供更多真实数 据。对于生物制药厂家，ZFN 有助于建立具有生长特性优化，糖基化特性改变，蛋白产量提 高等特点的细胞系。 3.锌指核酸酶的优势 锌指核酸酶能在用户指定位点造成DNA 双链断裂，有助于在活细胞内对基因组进行 靶向编辑。DNA 双链断裂刺激细胞启动自然DNA 修复过程，即同源重组或非同源末端连接， 从而诱发位点特异性重组。相对于传统的基因重组方法，锌指核酸酶技术不仅将基因组靶向 修饰的效率提高了3-5 个数量级, 而且具有极高的特异性。只需要5-8 周时间就可以得到 永久，可遗传的基因删除，插入和修饰的细胞系。