寡核苷酸 - 中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.12.3.2 寡核苷酸的优化设计 关键词：寡核苷酸；优化设计 中图分类号：Q524 在核酸分子杂交、DNA 序列测定和通过PCR 放大DNA 片段等实验中，都 需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的， 就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结 果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后 续实验的工作量，还可能一无所获。 怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。 1. 估测可能形成的DNA 或RNA 双链的稳定性 寡核苷酸，无论是DNA 的或者RNA 的，都有形成双链结构的潜在可能性， 正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种 结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相 对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自 由能(ΔG)来表示。现在，大多采用 Breslauer 等人提出的，以最接近的相邻核苷 酸的动力学数值( 自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都 在25 ℃条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是： 第一个(5′)核苷酸 第二个核苷酸 dA dC dG dT dA －1.9 －1.3 －1.6 －1.5 dC －1.9 －3.1 －3.6 －1.6 dG －1.6 －3.1 －3.1 －1.3 dT －1.0 －1.6 －1.9 －1.9 ΔG(kcal/mol) 例如，双链d(ACGG ／CCGT) 的ΔG 是： ΔG(ACGG) ＝ΔG(AC) ＋ΔG(CG) ＋ΔG(GG) ＝－(1.3 ＋3.6 ＋3.1) ＝－8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。也可以用 来计算发夹环结构的ΔG 。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的 数值。如3 个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4 个时为4.5 ；5 个为4.4 ；6 个是4.3 ；7 中国试剂网 3.12.3.2 和8 个为4.1 kcal ／mo1 。 2. 选择引物的一般规则 设计和选择引物时有5 个要素必需注意。 2.1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们 的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物， 极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG 是0～－2 kcal/mol 时，PCR 产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6 时 只有40% ，到－8 时少于20% ，而－10 时，接近于0 。虽然产量还取决于其他参 数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq 聚合酶操作时，由于它的工作 能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即 使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成 就有很大的依赖性。 2.2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构 的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG 为－3 kcal/mol 的自身互补引物也可 以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引 物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在 5′ 末端对反应就没有多大的影响了。 2.3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为 PCR 引物应当有 50%的 GC/AT 比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA 为模板，用81% AT 的引物可以产 生单一的，专一的，长250 bp ，含有70% AT 的产物。完全没有必要复杂地去计 算产物和引物的解链温度，PCR 引物的GC/AT 比率应当等于或高于所要放大的 模板的GC/AT 比。 要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差 异越小，PCR 的效率越高。因为DNA