小分子RNA分离.DOC

Northern Blot Analysis（LNA） 实验目的 是一类很小的分子，部分表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究目前多数研究人员采用Northern Blot——一种的方法来检测的存在（locked-nucleic acid, LNA实验原理 将待检测的通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,继而按其在凝胶中的位置转移到尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。实验过程（也可参考kit说明书） 提前配制无APS和TEMED的15%的Ura胶的混合液，即 50ml of Pre-GelsUrea 24 g 40% Acrylamide 18.75 mL 5x TBE Buffer 10 mL dH20 0 mL 器皿的清洗：器皿同Western Blotting装置。 用清水冲洗干净，乙醇擦干3%； H2O2 填充浸泡电泳槽、玻璃片、梳子10分钟； 用0.1% DEPC处理过的水冲洗电泳槽，梳子和玻璃片。 用RNAase Away 擦海绵和其他相关器材。 安装配胶装置。 配胶：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混匀，加入玻片中，加入10或15齿梳子。大约30-60 min 即可凝好。 RNA样品的准备 Small RNAs（大约107细胞） 或者Total RNA ~20-200ug 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加热 5min, 冰上冷却。 瞬时离心收集RNA样品。 电泳：（装置同Western Blotting电泳装置），电泳液为 1xTBE 15% Urea在电泳液 1xTBE进行电泳。电压180V 直到溴芬兰到达胶的底部。 根据Ambion公司的步骤，在上样之前，300V 预电泳10min（防止胶漏同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。其中我们选用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作为对照，同时将自己合成的RNA Oligo作为阳性对照（总量为1 pmol即可）。其中溴芬兰的对应的分子量为13左右，二甲苯青FF对应的为40左右。 转膜（装置同Western Blotting转膜装置），转膜液为0.5ⅹTBE。 将胶浸泡在0.5ⅹTBE大约 10min 。 用EtBr （0.5ug/ml）染胶10min 后，用紫外凝胶观测RNA电泳情况(参考Ambion公司的条带分析)。用0.5ⅹTBE 洗胶 5min. 用铅笔标记好转膜的面，将 Nylon membrane（GE公司）和两片厚滤纸浸泡在 0.5ⅹTBE 大约10min. 制备凝胶、膜夹层。将滤纸、胶、膜、滤纸形成三明治结构，注意胶应该靠近阴极侧。注意每层间不能有气泡。 装配好转膜装置装置同Western Blotting转膜装置。 于冰上300mA转膜 1 h。 把膜（RNA 面朝上）放在紫外交联仪中使用4000J UV进行交联. 将膜夹在厚的滤纸中间，80℃烘烤0.5-2 h，可以轻压，以防止膜发生翻卷。 如果可以直接做，则放在室温即可；也可以储存在4oC ，直到使用（可储存6个月）。 亚甲蓝（methylene blue）染色 3~5min, 在可见光下黄色滤光片对膜照相。 7. 杂交 1) 在杂交炉中37- 42℃ 在杂交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中预杂交1h , 然后将膜放入杂交袋，然后加入配好浓度的Dig-Labeled probe，在杂交炉中37- 42℃杂交过夜。 Dig-Labeled probe使用浓度：将10ul的25uM的公司原液稀释十倍后分装储存，取储存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6内参）或2.7-27ul储存液/10ml杂交液（根据miRNA的量或丰度定）。 37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。 室温MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。 室温用Blocking Solution (用MAB 10倍稀释10×Blocking Sol