微卫星标记分析大黄鱼卵裂雌核发育二倍体纯合性 - 水产学报.DOC

大黄鱼同质雌核发育的诱导及微卫星标记分析 吴清明1 蔡明夷1 刘贤德1 刘颖1 陈庆凯2 姚翠鸾1王志勇1 1集美大学水产学院厦门 361021）:Q 75; S 968. 3 　　　文献标识码:A 大黄鱼 (Pseudosciaena crocea) 是我国重要的海水鱼养殖品种之一，其养殖规模、产量、从业人员数量等都居于海水养殖鱼类之首。但由于长期的人工养殖和繁育，养殖大黄鱼出现种质退化现象，主要表现在性早熟、抗病力下降等，严重影响了大黄鱼养殖业的健康持续发展。因此大黄鱼优良品种的选育日益受到重视。传统选育方法培育一个品系至少需要3-5个世代，周期长，风险大。雌核发育是快速建立纯系的有效手段，在鱼类遗传育种中具有重要意义。大黄鱼异质雌核发育诱导及在基因作图中的应用已有多篇报道[1-5]，而同质雌核发育尚未见报道。 人工诱导同质雌核发育先利用遗传失活精子激活卵子的发育，再利用理化方法抑制发育卵的第一次有丝分裂，从而得到每个基因座位都纯合的雌核发育双单倍体（gynogenetic doubled haploid, GDH）[6,7]。这是快速建立鱼类纯系的有效手段。利用这种方法，已先后建立二十多种淡水鱼纯系[8]。而海水鱼同质雌核发育研究仅见牙鲆（Paralichthys olivaceus）[910]、真鲷(Pagrus major)[11]和欧鲈(Dicentrarchus labrax)[12]等少数几个种。本文在对诱导培育条件进行反复摸索优化的基础上，从2尾雌性大黄鱼的卵子诱导产生同质雌核发育鱼苗，利用微卫星标记进行遗传鉴定，并研究了这些标记在GDH后代的传递和分离情况，以期为大黄鱼纯系培育奠定基础。 1 材料与方法 1.1 雌核发育的诱导 试验工作于2007年春季在福建省宁德市水产技术推广站实验基地进行，亲鱼是已在网箱中养殖2周年，性腺发育良好、无病害的个体，按照王晓清等[1]所描述的方法进行人工催产，依李益云等[13]所描述的方法用紫外线照射进行（大黄鱼）精子遗传灭活，卵子在人工授精后51min（第一次卵裂开始的时间）施以静水压处理使染色体加倍，压力设定为40Mpa，处理时间3min；留部分已授精卵不作加压处理作为对照。试验期间水温保持在22±0.5℃。观察记录总卵数、发育卵数（发育到原肠期时统计）、孵化仔鱼数和正常仔鱼数。亲本取尾鳍固定于95%酒精中供提取DNA用。诱导后代在胚胎孵化后第2天，挑取躯干笔直、形态正常且活力强的初孵仔鱼固定于95%酒精中供提取DNA用。 按下面公式计算发育率，孵化率及仔鱼正常率： 发育率=发育卵数/总卵数×100% 孵化率=孵化仔鱼数/发育卵数×100% 初孵仔鱼正常率=正常仔鱼/总仔鱼数×100% 1.2 基因组DNA提取 采用标准的苯酚/氯仿/异戊醇法[14]从亲鱼尾鳍提取基因DNA，提取仔鱼基因组DNA时在蛋白酶消化完成后，仅用酚:氯仿(1:1)抽提一次，其余步骤同标准方法。琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的测定OD260[13]所述方法进行PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染；各个座位的等位基因按其迁移率从大到小依次定义为A、B、C、D（表3）。用2测验[15] 检验母本基因在雌核发育仔鱼中的分离是否符合孟德尔遗传定律。 表1 10个大黄鱼微卫星标记的核心序列、引物序列及退火温度 Tab.1 Core sequences, annealing temperature and primer sequences of 10 microsatellite DNA loci of large yellow croaker 微卫星座位核心序列引物序列’-3’) Primers sequence(5’-3’) 退火温度(℃)℃) GenBank登录号 GenBank Accession no. LYC0002 (TG)2(AC)2TC (AC)10CTAG(AC)5 F:ACCTCCAGTGGGATGTGA R:GGCTGTTTGTTATAATTTGTG 50 AY885692 LYC0004 (TG)11 F:CTCTTAGCCGTCATTCATCC R:CATTTAGCCAAGTTCACTTCC 55 AY885694 LYC0011 (TG)11 F:CTTTTATTGGCTCCGTATGA R:CACTCACACTAGCACGCAC 55 EF372246 LYC0012 (AC)7 F: CAGAACAAACAATGAATGGG R: GAGGAGCTCAACAGCAACA 55 EF372247 LYC0013 (GT)28 F:GCTGCGAGCTACTTTACTCAT R:AACTCACAAACATGCAC 50 EF372248 LYC0014 (AC)