酶工程实验报告四(纤维素酶酶促反应初速度的测定).doc

本科学生实验报告 学号 104120440 姓 名 孙 永 升 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 酶 工 程 实 验 教师及职称 李 俊 俊 讲 师 开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期 填报时间 2013 年 5 月 8 日 云南师范大学教务处编印 实验名称 实验方式 小组成员 实验四：纤维素酶酶促反应初速度的测定 小组合作 XX XX XX XX 实验目的 求出在一定条件下测定酶活力的初速度时间范围，并了解它的意义，了解浓度度对曲线的影响。 实验仪器、试剂和溶液： 2.1 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、标签（若干）、分析天平（感量0.01mg）等。 2 .2 试剂和溶液 2 .2.1 柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L，pH4.8 2 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液） 2 .2.3 DNS试剂（CMCA-DNS） 2 .2.4 纤维素酶液 3、实验原理或装置示意图： 原理: 产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线。曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延续，反应速度逐渐降低。这是由于：底物浓度的降低，产物浓度的增加加速了逆反应进行；产物的抑制作用，产物的积累导致pH改变；酶会部分失活。因此，为了准确表示酶的反应速度就必须采用初速度维持恒定的速度。在酶活力测定时，一般应先做进程曲线，然后再求出代表初速度的反应时间范围。 本实验采用最适pH、最适温度和足够高的底物浓度，来测定不同酶浓度下反应速度的时间范围。 4、实验方法步骤、操作流程及注意事项： 4 .1 实验方法与步骤： 1、 酶液制备 精确称取固体纤维素酶0.05g 、0.1g、 0.15g 、0.2g ，分别溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为0.5mg/mL、 1mg/mL、 1.5mg/mL、 2mg/mL的酶液。 2、预热 (1)分别取50mL的底物溶液和不同浓度的已制备好的纤维素酶酶液于250mL三角瓶中，在50 ℃水浴中保温10min。 （2）将保温后的酶液迅速倒入保温后的底物溶液中，振荡混匀，并立即用秒表计时，在50 ℃水浴中继续保温。 3、测定步骤 （1）保温时间：3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 20min、 25min、 30min、 40min、 50min、 60min。 （2）保温到不同的时间时，迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀。 （3）将两支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水20mL。摇匀，在540nm处读取OD值。 （4）空白管：在25mL试管中依次加入1mL底物溶液、 3mLDNS、 1mL对应浓度的酶溶液。（注意：每次加入溶液时均需充分混合均匀） 注意：原酶液的稀释对于测定反应初速度进程曲线很关键，四种酶液稀释浓度的OD值控制在0—1之间。 本实验在纤维素酶最适反应条件50℃、pH 4.8 下测定不同浓度下纤维素酶反应初速度值。 4.2 操作流程： A 制备不同浓度酶液 ↓ B 预热 ↙ ↘ 50mL的底物溶液 纤维素酶酶液于250mL三角瓶中 ↓ C 50 ℃水浴中保温10min ↓ D 保温后底物与酶液反应 ↓ E 不同时间保温 保温不同时间： ↓ F 测定 ↙ ↙ ↘ ↘ ①反应终止→ ②沸水浴5min → ③定容至25ml→ ④测定OD540吸光值 ↓ G 作酶反应进程曲线 4.3 实验注意事项 ① 反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释 ②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；