酶工程原理及应用-04 05 酶的工程化改造(分子修饰和固定化).pptx

酶工程 (原理及应用); 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。;现代酶工程的要求;酶应用过程中的一些不足;第四章 酶的分子修饰(改造);一、分子修饰的基本原理及策略;1、酶分子修饰基本原理;酶分子修饰的意义;酶分子修饰的基本策略（1） ;酶分子修饰的基本策略（2）;二、常用的修饰方法原理;2、酶分子的修饰方法 ;(1) 酶的金属离子置换修饰;金属离子置换修饰的过程 ;(2) 酶的大分子修饰非共价修饰;(2) 酶的大分子修饰非共价修饰;大分子修饰(共价)的过程;聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。;;;PEG-INF的制备过程;引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白;聚乙二醇修饰剂产品;IEF和SDS鉴定PEG修饰蛋白;RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段;质谱分析胰蛋白酶切片段;PEG修饰蛋白的结构鉴定;RP-HPLC分析PEG修饰蛋白;(3) 酶分子的侧链基团修饰;催化活性/非催化活性基团的修饰;常见基团的化学修饰反应：羧基;常见基团的化学修饰反应：氨基;常见基团的化学修饰反应：巯基;常见基团的化学修饰反应：咪唑基;常见基团的化学修饰反应：酚羟基;常见基团的化学修饰反应：胍基;常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基;(4) 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰);b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 ;c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活 ;氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。; ;(6) 酶分子的物理修饰 ;酶修饰后的性质变化;三、酶的定向进化技术;3、酶的定向进化;（1）酶分子的合理设计（蛋白质工程）;酶的合理设计;合理设计的技术需求;空间结构测定的专家： 主要应用X射线晶体结构分析的方法与技术对蛋白质分子的空间结构进行实验测定。 ;分子设计专家： 在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，主要通过理论的方法，提出蛋白质改性的设计方案，这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然蛋白质不同，这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的变化，从而能赋予新蛋白质什么样的特性。 当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具，采用基于物理学原理的各种模拟方法和基于蛋白质的改性分子结构知识的模型构建方法，或兼用这两类方法。;基因工程专家： 在得到了新的蛋白质的改性设计方案之后，就用一套分子生物学的技术，先合成相应的基因模板，再经过克隆与表达，得到新蛋白质的产物，最后通过分离、纯化，提取出足够纯的新蛋白质以研究它的性质。 蛋白质工程的这一程序不是一次就能实现的，往往要经过多次的循环，不断改进设计方案才能发现一个理想的新改性蛋白。;注意事项;1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。 定向进化技术 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。;目的基因;定向进化＝随机突变＋选择 在待进化基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化蛋白质, 从而排除其他突变体。;体外定向进化的意义;酶分子定向进化技术的关键;随机突变的策略;易错PCR;DNA改组和外显子改组;体外随机引发重组;多重组和随机多重组PCR原理图;RM-PCR法构建 随