鼠源单克隆抗体技术.ppt

第三章 鼠源单克隆抗体 廖振林 单克隆抗体简介 一般流程 动画 基本概念 抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体 Antigenic determinant 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope). 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团 Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体 杂交瘤技术的理论基础 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。 细胞DNA合成途经 1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T） 甲氨蝶呤（aminopterin） 甲氨蝶呤是一种叶酸拮抗剂，可阻断DNA合成的主要途径，这样DNA的合成需要补救途径来完成。该途径需要次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶脱氧核苷（T）等前体存在。而且细胞内要有次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、胸腺嘧啶核苷激酶（TK）存在。若缺乏其中一种酶，该补救途径便不能发挥作用。 HAT选择培养基的原理 HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T) 融合的结果及命运 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定 制备单克隆抗体的基本技术 1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAb的制备 7 单克隆抗体的纯化 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行） 选用6-12周龄Balb/c小鼠　 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效