三、病原菌的分离和(一)鉴定a.ppt

实验三 肠道菌的分离培养与鉴定 目的要求： 1．熟悉选择和鉴别培养基的原理； 2．了解大肠杆菌的主要培养特性； 3．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的常规鉴定方法； 基本原理 肠道菌大多为革兰氏阴性小杆菌，采用一般染色和分离培养难以鉴别，故须采用鉴别和生化试验培养方能鉴定。不同种类的肠道菌，产生的酶类和活性不同，在代谢过程中，产生分解产物和合成产物各不相同，利用细菌的生化特性，以生物化学的方法来鉴别细菌称为生化试验。 细菌分离培养和移植应注意下列事项： 1．选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长的培养基以及所需的气体与培养温度(病原菌一般为37℃)等。 2．严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰，接种环必须经火焰彻底灭菌；操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精灯火焰灭菌。 3．防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，否则会将细菌烫死；另外，还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。 4．纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。 一、肠道菌的分离培养法 (一)需氧菌分离培养法 1．平板划线法 此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散，以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。 术式 右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸人酒精灯火焰中烧至通红，再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面与水平面成45°角，接种环同培养基平面也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。 方法 接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实5-2中所示的几种划线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线，以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材料名称及日期，倒转置37℃恒温箱中培养。 一．鉴别（或选择）培养 （一）麦康凯琼脂培养基分离培养 1．原理 在培养基中含有胆盐，可抑制大部分革兰氏阳性菌（Gt）的生长，培养基含乳糖，大肠杆菌能分解乳糖，使pH下降（而中性红指示剂5.5--7.5，红--黄）形成红色菌落，而沙门氏菌和志贺氏菌，不能分解乳糖，菌落小而无色。 2．方法 将需要鉴别的肠道菌（大肠杆菌和沙门氏菌）或含肠道菌的病料，在康凯琼脂培养基上划线分离，37℃培养24h观察。使之得到单个菌落。 3．结果 大肠杆菌在此培养基上形成红色菌落，沙门氏菌形成无色或浅黄色菌落。 （二）SS琼脂培养基分离培养 1．原理 此培养以中性红作批示剂，其中还有胆盐硫代硫酸钠，构椽酸钠，煌绿等等抑制G+的生长，对大肠杆菌了有一定的抑制作用，只有少数生长。培养基中含有乳糖，在大肠杆菌能分解乳糖，产酸，指示剂显红色（5.0-7.4 红—黄），故大肠杆菌呈红色菌落，而沙门氏菌不能分解乳糖，没能使培养基变酸呈黄色菌落。 2．方法：将待检肠道菌和病料在SS琼脂培养基上划线分离置37℃培养24h观察。 3．结果：大肠杆菌呈红色菌落，沙门氏菌呈浅黄色菌落。 （三）伊红美兰琼脂培养基分离培养 1．原理 因大肠杆菌分解乳糖产酸，而伊红美兰在酸性环境中二者结合成紫色或紫黑色化合物，故大肠杆菌呈紫红色或紫黑色化合物，并带有金属光泽的菌落。而沙门氏菌不能分解乳糖，没能使培养基变酸呈粉红色菌落。 2．方法：将待检肠道菌在伊红美兰琼脂培养基上划线分离37℃培养24h观察。 3．结果：大肠杆菌呈紫红色或紫黑色并带有金属光泽的菌落而沙门氏菌呈粉红色菌落。 伊红美兰的结果 （四）双糖铁（或三糖铁）琼脂培养基 分离培养 1．原理：在培养基中含乳糖、葡萄糖（或蔗糖），在底部，大肠杆菌能分解全部糖。底部游离氧较小，发酵不能达到最后产物，因此，积累的酸类较多，故呈黄色。在上部（斜面），虽然有充足的氧，但积累的酸性产物仍然较多，故为黄色。 而沙门菌在发酵葡萄糖时，因底部游离氧较少，发酵不能达到最后产物，积累的酸类较多，故底部呈黄色。而上部，由于游离的氧气充足，发酵作用进行得较完全，能形成最后产物（CO2-和H2O）这样积累的酸类较少，指示剂酚红，不变色，若产生H2S，能形成硫化铁，而使培养基呈黑色。 三糖铁琼脂培养基的结果 2．方法：将待检查在斜面上划线，在深层穿刺，37℃培养24-48h观察。 3．结果：大肠杆菌在斜面和深层均为红色，而沙门氏菌在斜面为红色，在深层为黄色，若产生H2S有黑色的沉淀。 二．生化试验 1．糖发酵试验 1）原理 各种细菌具有