实验一+western+blot.ppt

2. 免疫反应： 将硝酸纤维素膜，在含蛋白质面用圆珠笔作方位标记和蛋白质分子量标准物位置标记；然后浸入漂洗缓冲液中漂洗2分钟, 去除漂洗液；加入封闭液，以液体展开后刚刚没过膜表面为宜，37℃保温振摇30-60分钟；加入适量一抗 (既每毫升封闭液中加入1-5微升抗体），4 ℃振摇过夜； 去除含一抗的封闭液，用漂洗液漂洗硝酸纤维素膜3遍，每遍加20ml漂洗液振摇5分钟，再加入含抗一抗的辣根过氧化物酶酶标二抗的封闭液，37℃振摇保温1-2小时。 2. 封闭 加入封闭液（5%脱脂奶粉TBST溶液或3%BSA TBST溶液），以液体展开后刚刚没过膜表面为宜，室温下置摇床1h； 3. 加入适量一抗（根据抗体说明书确定相应用量），4 ℃摇床过夜； 4. 取出膜条，TBST彻底清洗一抗，加入酶标二抗，37 ℃保温1h。 What’s happen? 目的蛋白（抗原） 一抗 带酶标的二抗 3. 显色检测： 根据酶标所用酶选用适当的显示方法。本实验采用辣根过氧化物酶标记抗体，相应地采用氯萘酚成色显示方法。倾去含酶标抗体的封闭液，用TBS漂洗硝酸纤维素膜3遍，各振摇5分钟；蒸馏水漂洗1遍，漓去水后在显色液中显色，轻轻振摇至显色深度不再增加，然后放入水中漂洗停止显色，照相存底，移到滤纸上干燥保存。 Summary 附1：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色显示方法 1. 固定漂洗（Fixing）： 待蛋白电泳进行到溴酚蓝带迁移至距离胶底0.5-1cm 处，关闭电源，倾去电极液，卸下胶模，取下胶块浸泡于5倍体积固定液中（ 只要分离胶）；放置于摇床上振摇30-60分钟。 2. 染色（Staining）： 弃固定液，加入5倍体积的染色液，于摇床上振摇2-16小时。 3. 脱色（Destaining）： 倾去染色液，加入5体积脱色液，于摇床上振摇至背景脱净，照相保存结果。 4. 干胶保存（Gel Drying）： 取玻璃板，裁取两张比玻璃板长出和宽出5-6cm 的玻璃纸，浸泡入水中10分钟。然后于玻璃板上铺一张浸泡过的玻璃纸，每边超出框架3cm 左右，将胶块置中间；再覆盖上一张浸泡过的玻璃纸，注意勿在胶块与玻璃纸之间留存气泡，最后将每边长出的玻璃纸翻向玻璃板下方卷折，四周用夹子夹紧，胶面向上平放过夜干燥保存。 Western Blot常见问题分析 SDS电泳 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 背景太高 1.膜没有均匀浸湿 2.膜或者缓冲液污染 3.封闭不充分 4.抗体与封闭剂出现交 叉反应 5.抗体浓度过高 原因 对 策 1.转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2.拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3.检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4.杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度 思考题 1. 蛋白质印迹分析能否用于检测未知蛋白质？为什么？ 2. 如果某一蛋白质的存在量足以用染色法直接显示，是否仍然会有必要进行操作较为繁琐的蛋白质印迹实验？为什么？ 蛋白质印迹分析 Western blotting 实 验 一 《医学生物化学与分子生物学实验教程》 P.216 实验时间安排 第一天 第二天 第三天 1.SDS胶制备； 2.样品制备和样品蛋白质含量测定； 3.电泳； 1.转移电泳 2.考马斯亮蓝染色 3.膜封闭 4.加1抗过夜温浴 1.洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色 2.加酶标2抗温浴 3.洗膜与显示 4.结果分析 Western blotting 蛋白质印迹一般由凝胶电泳、样品的印迹和 免疫学检测三个部分组成。 第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测 样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一 种固相支持物上， 常用NC 膜和 PVDF 膜。 第三步是用特异性