蓝舌病病毒BTV-1型的分离鉴定.pdfVIP

《上海畜牧兽医通讯》 2014年第 4期 ·5’ 蓝舌病病毒BTV一1型的分离鉴定 肖 雷 孟锦昕 李 楠 高 林 何于雯 杨 恒 胡 骑 李华春 朱建波 (云南畜牧兽 医科学院 650224) 蓝舌病 (BT)是 由蓝舌病病毒 (BTV)通过吸血 试验所用的BTV24个标准毒及 24个标准 阳性血 昆虫一库蠓叮咬传播，感染牛羊等反刍动物的一种 清由我室保存和制备 。 非接触性传染病 ，分布于热带、亚热带和温带地 区。 1．1．4 引物 的设计与合成 ：根据基 因库提供 的 主要侵害绵羊 ，其病症是颊黏膜和 胃肠道黏膜严重 BTV各基因序列 ，通过分析软件 ，对 BTV较为保守 的卡他性炎症 ，病羊精神沉郁，食欲丧失，常出现血 的 RNA7(VP7基 因)片断设计 引物 ：BTV-S7一A： 样下痢 ，常因蹄冠上皮脱落而跛行 ，被毛断裂 ，甚至 5’一GTTACAATGCGCCCGACATC一3’；BTV—S7一 全部脱落。蓝舌病病毒可经胎盘感染胎儿，引起流 B：5’一TGTAATGCGGC：CTGTCCAT一3’。扩增 产 产 、死胎或胎儿先天性异常 ，山羊和牛隐性感染 ，症 物长度为 555bp。引物 由大连宝生物工程公司合 状不明显 ，目前国际上的一些流行毒株可导致牛发 成 ，用 RNase—free ddH2O 稀 释 成 20pmol／gL 生明显临床症状 。 备用。 自1905年南非首次报道了蓝舌病以来 ，世界上 1．1．5 主要试剂及器材：总 RNA抽提试剂 (TR— 许多地区有该病发生 的报道 ，如美 国、澳大利亚、日 izo1)，天根生化科技有有 限公司 ，=j匕京 ；PrimeScript 本等 。1979年张念祖等在 中国云南省师宗县首次 OneStepRT—PCRKitVer2(DyePlue)试剂盒，宝 发现该病并成功分离到病毒 ，从而证明蓝舌病在 国 生物工程公司，大连 ；PremixEXTaqVer2(1oading 内的存在 。 DyeMix)，宝生物工程公 司。细胞培养瓶 (板)， 全球 已知至少有 24个不 同血清型 的BTV，其 Costar公司产 品，二氧化碳恒 温培养箱 (IF-151， 型与型之间不能产生或仅能产生较低 的交叉保护 ， SAKURA，日本 )，倒 置相差显微镜 (DMIL—Cplan， 这对动物的疫苗免疫造成很大的障碍 。为 明确本 德国莱卡)，PCR仪 (9700，ABI公司，美 国)，凝胶成 地区蓝舌病病毒 的主要血清型，2012年 ，我实验室 像系统 (Bio—Rad，美国)，鸡胚孵化箱 ，组织捣碎机。 在师宗县五龙乡建立 了一个 由 10头经蓝舌病抗体 1．2 方 法 检测为阴性、半岁至一岁 的黄牛组成 的监控群 (哨 1．2．1 病毒的分离。：选用动物血清学转 阳前 1周 兵动物)，从 5月份开始至 1O月，每周采血 1次 ，11 的肝素抗凝血 100gL，加入 到含 1mL无菌 PBS 月、12月每月采血 1次 ，从 8月初开始 ，第 1头监控 (pH：7．2)的 1．5mL微量离 心管 中，颠倒混匀 ， 动物出现蓝舌病血清学转 阳，用该牛转 阳前 1周的 1500r／min离心 10min，轻轻吸弃上清液，洗涤重 红细胞 ，经蓝舌病病毒分离程序，分离到 1株疑似病