基因敲除小鼠的实验流程.ppt

基本实验流程 一、动物基因组DNA的提取 实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 获取鼠尾组织 每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和10ul 蛋白酶K(20mg/ml)，55度水浴过夜，至鼠尾溶解。 提DNA步骤： 1. 每管鼠尾加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min 2. 取上清700ul至新的离心管中，加入预冷的异丙醇700ul，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到絮状DNA析出为止, 12500rpm 离心20min，弃上清 3. 加入800ul 75%乙醇于离心管中，洗沉淀，12500rpm离心10min 4. 晾干沉淀，加入100ul的PCR级的水。 二、PCR扩增 PCR:（20ul体系） 2x Mix 10ul 无菌水 2ul 2pmol引物1 2ul 2pmol引物2 2ul 2pmol引物3 2ul 模板DNA 2ul PCR扩增仪 三、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 * * 提取基因组DNA 获取鼠尾组织 PCR 扩增 琼脂糖凝胶电泳 成像分析 cycle 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以放大100万倍以上。 动画 95℃ 3min 95℃ 30sec 60℃ 30sec 72℃ 30sec 72℃ 5min 35 cycles 原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4℃~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。 *