谷氨酰胺转氨酶.ppt

谷氨酰胺转氨酶 南京工业大学 2011级食品科学 汪开银 目录 第一、介绍 第二、分离与纯化 第三、理化性质的研究 第四、应用前景 第一、介绍 谷氨酰胺转氨酶( Transglutaminase，EC2． 3． 2．13，简称TGase) 是一种催化酰基转移反应的转移酶。它具有多种催化功能，能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构和功能特性。 因此，TGase 在食品、生物医药、组织工程、纺织和皮革工业中都有着广泛的应用前景。 第二、分离与纯化 1.1 主要仪器和试剂 J2-MC 微控高速冷冻离心机；ImageMaster VDS 胶成像分析系统；冷冻干燥机。 N-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸γ-单羟肟酸、还原型 谷胱甘肽、羟胺。 香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇等。 1.2 谷氨酰胺转氨酶活测定方法 Grossowicz 比色法测定酶活力， 以Nα-CBZ-Gln-Gly 和羟胺为作用底物， 以L-谷氨酸-γ-单羟肟酸作标准曲线。一个谷氨酰胺转氨酶活力单位定义为：37 ℃时每分钟催化形成1 μmol L-谷氨酸γ-单羟肟酸的酶量为一个酶单位。 从标准曲线求出酶活： 酶活力/（U /mL）=7.983 5×A525×稀释倍数/10 1.3 提取 经过初步试验，确定食用菌中的谷氨酰胺转氨酶是一种胞外酶。从新鲜香菇子实体中提取谷氨酰胺转氨酶粗酶的工艺流程为： 分别测定香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇的谷氨酰胺转氨酶粗提液的谷氨酰胺转氨酶酶活性，结果分别为0.261、0.116、0.115、0.276 U/mL。可见不同菌种的谷氨酰胺转氨酶酶活性有较大的差异，香菇和杏鲍菇的谷氨酰胺转氨酶酶活性较强，平菇、金针菇的谷氨酰胺转氨酶的酶活性较弱，从它们的比活性来看，杏鲍菇最高，但市场上杏鲍菇的价格远远比香菇贵，且香菇容易获得，所以选用香菇作为以后的试验材料。 超滤方法 采用WB-3 型的中空纤维膜， 截留分子量为30 000 u，在加冰冷却的条件下，保持泵出水压为0.4MPa，对粗酶滤液进行超滤循环，直到达到相应的浓缩倍数，收集浓缩液。 乙醇沉淀 取粗提取液100 mL，按V（提取液）∶V（乙醇）=1∶1；V（提取液）∶V （乙醇）=1∶1.5；V（提取液）∶V（乙醇）=1∶2体积分数比分别加入经预冷至0 ℃的95 ％乙醇，迅速搅拌，将混和液离心（3 ℃，10 000 r/min，10 min），所得沉淀用0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH6.0）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容于100 mL，测定酶活，计算酶活收率。 （酶活收率分别为40 ％、38．7 ％、40．8 ％） 丙酮沉淀法 实验方法与乙醇相同。 （酶活收率为59.2 ％） 饱和硫酸铵沉淀 室温下， 加不同量的硫酸铵到100 mL 经超滤后的提取液（预冷至0℃）中，形成浓度为20％、40％、60％、80％的硫酸铵溶液，保持6 h 后，离心（10 000 r/min、3℃、5 min）， 将所得沉淀用0.2 mol/L Tris -HCl 缓冲液（pH6.0）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容于100mL，测定酶活，计算酶活收率。（在60%时酶活最高，达到56.9%） 不同沉淀法对酶收率的影响 分别采用60 %饱和硫酸铵沉淀、95 %乙醇与丙酮沉淀法对粗酶进行沉淀分离，3 种沉淀法的酶活收率分别为56．9 %、43．6 %、59.2 %。 结果表明用丙酮和饱和硫酸铵沉淀的酶活收率要比乙醇沉淀酶活收率稍高一些。但是饱和硫酸铵沉淀法在酶液中引入了水溶性无机盐， 需要进行脱盐等步骤，较繁琐。有机溶剂沉淀法则不需脱盐及多次分离等步骤，过程短，且其为挥发性液体，在干燥中可挥发成气体而不残留， 或仅留其痕迹。而考虑到作为食品用酶，最好不用丙酮沉淀法，所以最终采用乙醇沉淀。 第三、理化性质的研究 3.1 粗酶的最适温度 冷冻干燥后的粗酶制成酶液分别在20、30、40、50、60 ℃下测定酶活，以最高点酶活为100 %。 3.2 温度对粗酶稳定性的影响 冷冻干燥后的粗酶制成酶液， 分别在20、30、40、50、60 ℃的水浴中保留10 min，用冰浴快速冷却，然后在37℃下测定酶活，以未经处理的酶液酶活为100%。 3.3 pH 对粗酶