miRNA-9通过Notch通路调控骨性关节炎软骨细胞增殖和分化的机制研究211概要1.doc

miRNA-9通过Notch通路调控骨性关节炎软骨细胞增殖和分化的机制研究 论文的创新点： 骨性关节炎是骨科常见病，其发病机制仍尚不清楚。近年来，miRNA被发现能够参与细胞增殖、分化、凋亡等多种信号调控通路，以及多种生理和病理过程。但总体来讲，miRNA与骨性病变的直接相关性研究还较少。 Notch 通路是调节软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化的关键通路之一。据报道，激活Notch通路可促进软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化。目前有研究发现的异常调控与骨性关节炎的发生密切相关。本研究通过构建miRNA-9的真核表达载体，探讨其软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化，并分析miRNA-9对Notch通路的调控作用。 将传代的关节炎软骨细胞分为:A组:PEF miRNA-9和PSV2neo共转染组, B组:和PSV2neo共转染组, C组。A组为实验组, B,C两组为阳性对照组和阴性对照组。采用Real-time PCR检测miRNA-9在两组骨性关节炎细胞中的表达，采用流式细胞法检测过表达的miRNA-9对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，利用MTT 法及ALP检测观察Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。著下调Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。 本研究结果证实，Notch 信号通路在骨性关节炎软骨细胞向成骨细胞诱导分化中起积极作用。miRNA-9抑制了软骨细胞向成骨细胞的分化。这种抑制可能是通过下调 Notch信号通路的配体 Jagged1 和受体Notch1 来实现的。我们分析，miRNA-9可能通过激活 cAMP/PKA、PLCPKC 等信号通路发挥作用为进一步了解骨性关节炎奠定了一定的实验基础。 将传代的关节炎软骨细胞分为:A组:PEF miRNA-9和PSV2neo共转染组, B组:和PSV2neo共转染组, C组。A组为实验组, B,C两组为阳性对照组和阴性对照组。采用Real-time PCR检测miRNA-9在两组骨性关节炎细胞中的表达，采用流式细胞法检测过表达的miRNA-9对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，利用MTT 法及ALP检测观察Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。结果著下调Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。结论：miRNA-9过表达可能通过下调Notch通路的表达进而抑制骨性关节炎软骨细胞的分化。 【关键词】骨性关节炎；miRNA-9；Notch通路；增殖和分化 Study on the mechanism of 骨性关节炎是骨科常见病，目前对于骨性关节炎的发病机制仍尚不清楚[1-4]。Notch 通路是调节软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化的关键通路之一。据报道，激活Notch通路可促进软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化。目前有研究发现的异常调控与骨性关节炎的发生密切相关[5-8]。本研究通过构建miRNA-9的真核表达载体，探讨其软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化，并分析miRNA-9对Notch通路的调控作用。 1表达载体、pSV2neo筛选质粒购于美国Invitrogen公司蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司RM2155 型超薄石蜡切片机产自德国LEICA 公司;AllegraTM 64R台式低温高速离心机产自德国Beckman公司小鼠抗人Jagged1，Notch1购自美国Assay Biotechnology公司。 正常软骨细胞、关节炎软骨细胞的培育： 置38℃,5%CO2细胞培养箱常规培养, 等到细胞长满后,用0.3%的胰酶消化传代。 1.2 实验分组与质粒转染： 将传代的关节炎软骨细胞分为:A组:PEF miRNA-9和PSV2neo共转染组, B组:和PSV2neo共转染组, C组。A组为实验组, B,C两组为阳性对照组和阴性对照组。按照说明书进行转染,加入400μgPmlG419筛选,经3周后形成阳性克隆组,扩增培养,备用。 1.3 Real-time PCR检测miRNA-9在3组细胞中的表达和转染 提取3组细胞的总RNA，用于检测miRNA-9在3组细胞中的表达差异。上游引物为5’-TGC GAT CCA GTT GGT CGT-3’，下游引物为5’-CTT TTT GCT AGT TCG GTT ACC-3’，U6作为内参。转录条件为：37℃ 15 min，85℃5 S。PCR扩增条件为95℃10min，1min预变性，95℃15 S，60℃ 30 S，72℃ 45S，重复40个循环，计算3组细胞中miRNA-9的表达量。 1.4 miRNA-9过表达对关节炎软骨细胞凋亡影响的检测 采用流式细胞仪法，收集组待测细胞，种于6孔板中调整细胞密度至5×10细胞/ml，加入10μlAnexinⅤ混匀，室温暗处温育染色15min，在上机前5m