叶酸代谢能力基因检测操作流程.docx

MTHFR C677T , MTHFR A1298C,MTRR A66G基因检测操作流程实验流程一、操作步骤适用仪器：普通PCR仪样本要求：EDTA抗凝剂的静脉全血（100μl），室温保存不超过7天， 2～8℃保存不超过1个月，-20℃保存不超过3个月，反复冻融次数不超过5次；DNA的浓度应不低于5ng/μl， A260/ A 280应在1.6~2.0之间。有血块的样本需经匀浆处理或用组织研磨仪研磨处理后再进行全血DNA的提取。检验方法：（试剂盒中的检本测卡、阳性/阴性对照卡上标识解释如下：M表示突变型，WT表示野生型，C表示质控线，T表示检测线。）A： 样本DNA的制备试剂盒准备工作：1、清洗液BW-I：用50 ml量筒分别移取35 ml无水乙醇（分析纯）和35 ml异丙醇加入至清洗液BW-I试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。2、清洗液BW-II：用50 ml量筒移取49 ml无水乙醇加入至清洗液BW-II试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。3、蛋白酶K准备：取出蛋白酶K，室温解冻，涡旋混匀后备用。4、磁性微粒准备：将磁性微粒涡旋混匀，保证均一。实验操作步骤：将20 μl蛋白酶K溶液加入2 ml 离心管的管底。依次加入100 μl全血、200 μl裂解液BL，用涡旋振荡器混合15 sec(以下简称涡旋混匀)，56 ℃水浴20 min。向步骤1裂解处理的样品中依次加入300 μl结合液BI、25 μl的磁性微粒（移取前必须充分涡旋混匀），涡旋混匀，室温静置5 min。磁性分离5 min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入400 μl清洗液BW-I，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清；重复本步操作，以400μl清洗液BW-I重复清洗一次。从磁性分离器上取出离心管，加入400 μl清洗液BW-II，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清（尽可能弃去所有的清洗液BW-II）。打开离心管盖，将其室温晾干5 min。从磁性分离器上取下离心管，向管中加入100 μl 洗脱液ES，涡旋混匀，56℃水浴5 min。将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清。将上清液（分离纯化得到的DNA溶液）转移到2 ml离心管中，直接用于下游实验或于-20 ℃保存备用。B：PCR扩增液准备（1）每人份需做两个反应，取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT。（2）将试剂从-20℃取出平衡至室温，瞬时离心。在标有M的管中加入29μl 扩增液（M），在标有WT的管中加入29 μl扩增液（WT）。 （3）分别向以上M和WT各管中加入1μl反应液。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心待用。C：待检测DNA样本的配制在上述标有M、WT管中分别加入3μl待测基因组DNA，分别再加入17μl ddH2O使终体积为50 μl。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心。D：PCR扩增将PCR管放入PCR仪中，按如下程序扩增：50℃ 2min；95℃ 5min； 94℃ 30sec、60℃ 30sec、 65℃ 1min（26Cycles）；65℃ 10min； 4℃ Hold。取出PCR产物，2~8℃保存。E： 检测卡检测实验从密封袋中取出检测卡，将待测样本M与WT管中的PCR产物分别滴加在检测卡对应的样品垫处，待2~5 min对结果进行判读，20min后结果不可靠。F：质量控制（1）检测结果中阳性对照应在阳性对照卡检测线（T线）出条带，阴性对照应在阴性对照卡检测线（T线）不出条带。正常检测时，应定期进行阳性对照品及阴性对照品实验。（2）阳性对照品实验：取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将20μl M阳性对照液、20μl WT阳性对照液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，再依次分别加入M扩增液29μl及1μl反应液、WT扩增液29μl及1μl反应液，按照步骤中D~F完成，检测线（T线）及质控线（C线）均应出现条带。（3）阴性对照品实验：取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将M扩增液29μl、1μl反应液及WT扩增液29μl、1μl反应液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，再分别加入20μl阴性对照液，按照步骤中D~F完成，质控线（C线）应出现条带，检测线（T线）应无条带出现。G：结果判读（如下图、下表）如上图一所示，以阳性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T线）有条带出现，作为阳性对照；以阴性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T线）无条带出现，为阴性对照。若阴性样本有条带出现，有可能加