动物克隆技术 复旦本科生06 09.pptVIP

1、何为克隆？ 3、实现哺乳动物无性繁殖的途径？ 体内培养的NT羊胚胎 卵母细胞去核率 约70% 移核成功率 约90% 融合率 约80% 重构胚发育成囊胚 约30% 移入受体母畜产生后代 约30% 核移植最终获得后代 约3.8% 四、精子介导法 将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。 最引人注目的报道是意大利学者Lavitrano 等在小鼠上进行的研究, 他们将获得的小鼠附睾精子与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起37℃孵育30min 后, 再与成熟卵子进行体外授精, 这样得到的胚胎在2- 细胞期移植入受体鼠的输卵管内, 在受体鼠产出的250 只体外受精鼠有30%(70/250)为阳性个体。实验还发现阳性个体中转入的基因可以稳定地整合入生殖细胞系, 而且在转基因的后代个体的组织器官中, 特别是在尾组织和肌肉组织中可检测到CAT 基因的表达。Lavitrano, M. et al. (1989) Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57, 717–723 在Lavitrano 的文章发表不久, Binster 等根据Lavitrano 的实验方案, 用近10 种基因结构、6个不同品系的小鼠、多种培养液和不同基因浓度在得到的1 500 只小鼠中没有阳性结果, 这使人们对精子载体法变得谨慎和怀疑. SMGT 方法离不开精子。精液来源、精液品质、精清、精子质膜和精液处理方法等构成了SMGT 方法的精子因素。同时,SMGT 方法被认为制备转基因小鼠、猪、兔、羊. 精子载体转基因机理 精子携带外源DNA 的条件 Spadafora 等1998 年的研究结果表明, 几乎所有动物的精子都具有与外源DNA 结合的能力,但只有附睾精子和经洗涤去除精清的射出精子才能够有效携带外源DNA, 这说明精清中的某些成分强烈抑制外源DNA 的结合。在自然受精时, 因为精清对精子的保护作用, 杜绝了外源遗传物质对遗传稳定性的干扰, 避免了物种的变异。目前,已在哺乳动物精清中和低等动物(如海胆)的精子表面发现了一种颉颃DNA 结合的抑制因子(称为IF- 1), 来源于海胆精子的IF- 1 的提取物经纯化分析, 确定它是一种37 kDa 的糖蛋白. □精子结合外源DNA 的核内化过程 核内化的发生是在结合的最初几分钟开始并有精子细胞膜上CD4 分子进行信号传导, DNA 结合蛋白(DBP)与外源DNA 形成的核蛋白复合体(DBP/DNA)是产生核内化的触发信号, 使得DNA/DBP/CD4 复合体进入精子内并穿过核孔抵达核基质区, 此时DNA 与DBP/CD4 解离, DBP和CD4 分子返回精子细胞膜, 继续介导其他的外源DNA 进入精子细胞核内, 而外源DNA 则与核基质(MAR)区在染色体的拓朴异构酶的作用下发生外源基因的整合。 精子与外源DNA 结合的因素 DNA 片断的长短, 大片段(7kb)较小片段(150～750bp)更容易被精子所摄取 DNA、多聚阴离子、低等电点的蛋白质等物质与精子相结合的过程中这些分子的电荷密度具有决定意义。分子电荷性的重要性最近已得到进一步证实: 精子- DNA 复合体可以很容易地被高盐溶液(250～700mmol/L NaCl 离子梯度)分开[14]。由于多聚阴离子物质在精子头部结合部位相同, 因此存在一种特殊底物蛋白即DNA 结合蛋白(DBP), 这种蛋白充当精子和核酸相互作用底. 正常生理条件下, 动物排出的精液中含有特异的抑制因子IF- 1, 使精子失去了与外源DNA 的结合能力。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与DNA 结合效率. 精子获能是一个极其复杂的生理过程, 受多种因素的影响, 其中与Ca++、K+、Na+ 等离子的浓度密切相关. 小结 （三）上海转基因研究中心 获得的克隆动物 SP3179号波尔羊克隆羊 SP3179 CB-1 CB-2 CB-3 CB-4 CB-5 CB-6 CB-7 138号杂交一代波尔羊克隆羊 138 CO-2 CO-4 CO-6 CB-1O CO-12 CO-14 CO-16 CO-8 No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 No.8