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真菌病 真菌病 真菌病 真菌病 ?目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类。 常规检查法主要包括：①形态学检查（直接镜检+染色镜检）。②培养检查。③组织病理学检查。 特殊检查主要包括：①血清学方法。②分子生物学方法。 真菌病 临床样本的采集与处理 （一）皮屑??边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同时种于沙氏琼脂加氯霉素2管，置25℃培养2周。 （二）甲屑??用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后种于沙氏（SDA）培养4周，并同时作KOH涂片。 真菌病 （三）毛发??取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检，5～10根种于沙氏琼脂（加氯霉素），划破斜面掩埋。 （四）脓液??无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作G染色或抗酸染色。常规的KOH涂片及SDA接种培养也是必要的。 真菌病 （五）CSF??采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养（SDA）25℃或37℃4周。 （六）血液??无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。 真菌病 （七）体液、痰液、尿液、粪便?。 （八）组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm3的小块，KOH涂片培养。 真菌病 真菌病 真菌病 真菌学检验的基本技术（一）直接镜检标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列。?? 真菌病 直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有： ①氢氧化钾/复方氢氧化钾法 ②胶纸粘贴法 ③涂片染色检查法 真菌病 （二） 真菌培养 根据不同的临床标本，大体可分为点植法和划线法两种。①点植法：适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本，将标本直接与培养基表面点状接触。②划线法：适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本，用接种针（环）划线接种在培养基表面。 真菌病 真菌病 真菌病 临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法； ①直接培养：采集标本后直接接种于培养基上。②间接培养：采集标本后，暂保存，以后集中接种。 真菌病 按培养方法分为试管法、平皿法（大培养）和玻片法（小培养）。 试管培养：是临床上最常用的培养方法之一，培养基置于试管中，主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存。 大培养：将培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内，主要用于纯菌种的培养和研究。 小培养：主要用于菌种鉴定，大致分为三种：玻片法，方块法和钢圈法。小培养可置普通显微镜下直接观察，而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查。 真菌病 培养物观察指标标本接种后，每周至少检查2次。1.菌落生长速度：缓慢生长菌：7～14d，快速生长菌：2～7d。一般浅部真菌超过2周，深部真菌超过4周仍无生长，可报告阴性。 2.外观：a.扁平。b.疣状。c.折叠规则或不规则。d.缠结或垫状。e.其他。 3.大小：菌落大小用cm来表示，菌落大小与生长速度和培养时间有关。 真菌病 4..质地：a.平滑状。b.粉状。c.粒状。d.棉花状。e.粗毛状。 f.皮革状。g.粘液状。h.膜状。 5..顔色：不同的菌种表现出不同的顔色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的顔色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也可变色，如马尔尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有顔色，其背面也有深浅不同的顔色 。 真菌病 (三)组织病理学检查??真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值，尤其对深部真菌病的诊断意义更大，如用特殊染色可提高阳性率。 真菌病 （四）免疫诊断方法：①特异性抗原的检测：乳胶凝集试验（LA）、酶联免疫试验（EIA）、荧光免疫测定法（FA）。②特异性抗体检测：由于受检者都为免疫低下患者，因其致阳性率低，故现已少用。 真菌病 （五）分子生物学方法 近年来随着分子生物学的发展，已有聚合酶链反应（PCR）扩增、分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、DNA指纹图谱、随机扩增DNA多态性（RAPD）等方法。用