2014生化2-氨基酸与蛋白质的一级结构.ppt

多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 末端基氨基酸测定 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 末端基氨基酸测定 二硝基氟苯（DNFB）法 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 末端基氨基酸测定 丹磺酰氯法 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 末端基氨基酸测定 氨肽酶法 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 末端基氨基酸测定 羧肽酶法 2测定步骤 (6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 蛋白质一级结构的测定 ? 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 多肽链的选择性降解 酶解 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种： Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。 水解位点 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 水解位点 糜蛋白酶 Pepsin：R1和R2均要求为疏水氨基酸。专一性与糜蛋白酶相似,但其最适pH为2,后者为8-9 水解位点 胃蛋白酶 thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 水解位点 嗜热菌蛋白酶 分别从肽链羧基端和氨基端水解 肽链 水解位点 羧肽酶和氨肽酶 ? 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 多肽链的选择性降解 (7)测定每个肽段的氨基酸顺序。 蛋白质一级结构的测定 Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 Edman氨基酸顺序分析法 (8)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 蛋白质一级结构的测定 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。 蛋白质一级结构的测定 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析， 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。 二硫键位置的确定 请根据下列信息确定一个十肽序列 1摩尔十肽经过一轮Edman降解后产生两摩尔PTH-Asp 用2-巯基乙醇处理该十肽，然后再用胰蛋白酶处理产生三组肽段： Ala, Cys, Phe Arg, Asp Asp, Cys, Gly, Met, Phe 其中第一组肽段经第一轮Edman降解产生 PTH-Cys 1摩尔十肽经羧肽酶处理产生两摩尔Phe 第三组肽段与溴化氰反应产生两组肽段（肽酰高Ser内酯,Asp)和（Cys，Gly，Phe），其中第二组经Edman降解产生PTH-Gly。 * 2.5 蛋白质的一级结构 primary structure The primary level of structure in a protein is the linear sequence of amino acid