3.1生物分离纯化技术及其选择(选材与破碎).ppt

生物技术实验 理论讲课的内容 第一部分：生化分离制备的特点及基本原理 第二部分：生物大分子制备方案的设计程序 第三部分：分离纯化技术及其选择 第四部分生物大分子分离制备方案设计举例 第五部分 方案设计与实验研究选题 第三部分生物分离纯化技术及其选择 一、材料的选择 二、细胞破碎 三、提取方法的选择 四、沉淀分离及其应用 五、后期纯化方法及其应用 一、材料的选择 目标物在细胞内的分布与含量变化 实验材料的来源 （动、植物、微生物） 1、目标物在细胞内的分布与含量变化 分布于细胞核的酶 分布于细胞溶质的酶 分布于内质网的酶 分布于线粒体的酶 分布子溶酶体的酶 生物体不同组织中酶的含量 生物体不同发育期酶含量的变化 分布于细胞核的酶 分布于细胞溶质的酶 分布于内质网的酶 分布于线粒体的酶 分布子溶酶体的酶 生物体不同组织中酶的含量 生物体不同发育期酶含量的变化 2、实验材料的来源（动、植物、微生物） 动物器官与组织 植物器官与组织 细胞培养产物 微生物发酵培养产物 其它：代谢物、分泌物以及昆虫等 动物器官与组织 动物脏器制药所用的动物器官与组织，如猪、牛、羊等动物的肝脏、胰腺、脑下垂体、脑组织以及鸡胚胎等，其他低等或高等动物包括海洋生物的器官与组织均含有丰富的药物成分。 转基因动物体内外源药物基因表达产物富集的特定器官与组织，特别是乳汁等体液或分泌液等。 转基因技术的发展将使人类有可能把珍贵的蛋白质药物基因转移到诸如奶牛、奶羊体内，使目的蛋白质在乳腺内表达并随乳汁分泌出来，这样的转基因动物将成为活的、可饲养的生物药物“矿藏”。 植物器官与组织 如植物的根、茎、叶、果实与种子等。除植物器官和组织中固有的药用成分外，已可以用转基因技术将所需药物成分的编码基因转入植物，这样的转基因植物将成为活的、可种植的生物药物“矿藏”。 通过种植收获转基因植物即可获得大量有保障的、以传统方式很难获得的珍惜药物原料。 细胞培养产物 允许用于生产药用成分的哺乳动物传代细胞有人胚肺二倍体细胞(2BS细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)以及非洲绿猴肾细胞(Vero细胞等)，原代地鼠肾细胞、鸡胚成纤维细胞等用于乙脑、痘苗等疫苗的生产已有较长的历史，这些动物细胞作为基因工程药物的重组宿主细胞已得到广泛应用，有着广阔的应用基础与前景。 微生物发酵培养产物 以重组酿酒酵母为宿主系统制造药品的技术已较为成熟，酿酒酵母细胞的基因组全序列已于1996年破译。经遗传工程技术改造的甲基营养型毕赤酵母和汉逊酵母具有培养基成分简单和外源基因高表达的良好工艺性能，在生物制药领域中异军突起。 细菌发酵培养产物 如大肠杆菌是应用最为广泛最为成熟的基因工程药物的重组细菌宿主细胞系统。 二、细胞破碎技术及其应用 （一）细胞破碎的意义 （二）细胞壁的成分与结构 （三）细胞破碎过程的检测 （四）细胞破碎技术及其应用 （一）细胞破碎的意义 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。 细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系 细胞破碎过程中必须考虑的因素 细胞壁的坚韧程度 、目标产品的性质 、破碎的规模、方法 、费用等 （二）细胞壁的成分与结构 细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多层网状结构。 霉菌的细胞壁大多由几丁质和葡聚糖构成，还含有少量蛋白质和脂类。 酵母和真菌的细胞壁为葡聚糖为β-1，6葡聚糖，通过β-1，3糖苷键与D-葡萄糖第一侧链交联，也含有甘露糖和几丁质 原核细胞的结构 酵母细胞的结构 植物细胞的结构 （三）细胞破碎过程的检测 ①用革兰氏染色剂进行染色：破壁的酵母呈粉红色，而未破壁的酵母呈兰紫色，采用0.05%美蓝染色，破壁的酵母呈蓝色，而未破壁的酵母呈无色状态，分别计数，并采用相同的稀释度用血球记数板进行镜检记数，计算破壁率。 0.05%美蓝染色结果 （三）细胞破碎过程的检测（续1） ②用次甲基蓝染色测定细胞存活率: 取未经灭酶的发酵液 0.5ｍＬ ,用 9ｇ/Ｌ的生理盐水稀释 1 0 0倍后 ,用次甲基蓝染色5ｍｉｎ ,用血球计数板计数 ,计算出细胞的存活率。 酵母存活率 ： =[1 -(染色细胞总数 /酵母细胞总数 ) ]×100 %. （三）细胞破碎过程的检测（续2） ③测定核酸与蛋白质含量判断细胞破碎率: 分别在 2 60和 2 80ｎｍ波长下 ,测定发酵液的光吸收值，用Lorry法测量细胞破碎后上清中的蛋白质含量也可以评估细胞的破碎程度。 核酸提取率： =[(处理后发酵液的吸光值 /未处理发酵液的吸光值