f02蛋白质化学一：氨基酸与蛋白质一级结构s.ppt

5-16 ? 蛋白质具有高级层次结构 - 纤维蛋白的特性一般在二级结构上即可表现出来 - 球蛋白的生物学功能往往需要以三级结构形式来实现 - 酶等特殊球蛋白大多要在四级结构层次上才能表达其活性 (covalent bond) (hydrogen bond) (3D for a peptide) (3D for more peptides) urea biuret Zp122 Cu2+ OH– 紫红/蓝紫色化合物 - 双缩脲由两分子尿素加热至180℃时缩合而成，在碱性 溶液中能与CuSO4反应生成紫色络合物 - 蛋白质中的肽键与之类似，也能经由该反应变为红紫色 - 双缩脲反应既可用于蛋白质的定性鉴定，也可经540nm 比色定量测定(revising with Kjeldahl method) ① 双缩脲反应 (含2个及更多肽键的化合物) ? 蛋白质颜色反应 蛋白质中的一些基团能与某些特定的试剂反应而生成有色物质，可用作定性及定量检测依据 ② 黄色反应 (苯环可被硝化生成硝基苯衍生物) - 含有芳香族AA (esp. Tyr Trp)的蛋白质在溶液中 遇到硝酸时可产生白色沉淀，加热后变黄，再加碱 则颜色加深为橙黄色 - 皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄 ③ 米伦反应 (酚类化合物) - 米伦试剂是硝酸汞、亚硝酸汞硝酸和亚硝酸的混合物 - 蛋白质加入米伦试剂可产生白色沉淀，加热后变红 - Tyr及含该AA的化合物都有此反应 ④ 乙醛酸反应 (含吲哚基的化合物) 在含Trp的蛋白溶液中加入乙醛酸后再沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环 ⑤ 坂口反应 (含胍基的化合物) Arg的胍基能与次氯酸钠/次溴酸钠及?萘酚在NaOH溶液中产生红色物质，可用于鉴定含Arg的蛋白质及定量测定Arg ⑥ 福林反应 (Folin-酚法) - Tyr的酚基能还原福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸 而生成蓝色化合物 - 为双缩脲反应的发展，灵敏度更高 ? 蛋白质功能依赖于其氨基酸序列 ? 短肽可采用自动法测序 ? 大蛋白需要分解成小肽段后再测序 ? 小分子多肽和蛋白质可以化学合成 §3. 蛋白质一级(共价)结构 Frederick Sanger (1918-) The only scientist who got NP for Chem. in twice (1958 1980). ㈠ 蛋白质功能依赖于其氨基酸序列 - 各种蛋白质均具有其独特的AA序列，可决定蛋白质 以何种方式折叠、盘绕成独特的3D构象(功能基础) - AA序列异常有可能导致遗传病(by 1 AA 1/3) eg. sickle cell anemia: β链Glu6→Val6 - 不同物种的相似功能蛋白质常具有类似的AA序列 eg. Ser-proteases的催化三联体 泛蛋白的全部76 AA对果蝇和人均完全相同 P6-3 对酸水解远 比肽键稳定 ㈡ 短肽可采用自动法测序 TFA 确定肽链的AA组分 鉴别肽链的N-端残基 (Sanger reagent) 鉴别肽链的N-端残基 以Edman降解法测定 短肽链的AA序列 PTC基 PTH-Aa (~270nm absop.) DNP-Aa 苯异硫氰PITC PTC基的引进只降低 1st个肽键的稳定性 TFA (三氟乙酸) cleaves N-terminal AA but leaves rest of polypeptide chain intact - 氨肽酶法 Ala Val Gly - 羧肽酶法 ? 肽链末端亦可用酶法测定 ? Edman法的测定长度取决 于每轮循环降解的有效率 以N-末端为Gly-Pro-Lys-的肽链为例，如果每轮循环切除的有效率为97%，则… 1st Gly Pro-Lys- 97% Gly-Pro-Lys- 3% cycle PTH-AA shortened peptide 2nd Pro 97% Lys- 97% Gly 3% Pro-Lys- 2.9% Gly-Pro-Lys- 0.1% 3rd