细胞工程-第九章 转基因动物与生物反应器11.10.ppt

第九章 转基因动物与生物反应器 转基因小鼠模型 转基因兔、牛、猪、羊、 鱼、小鼠… … 转基因动物模型优势： 受精卵显微注射制备转基因动物的缺点 优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 　 优点： 　　 保证大片段ＤＮＡ的完整性 。　 保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高 。　 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性 , 因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。 5 酵母人工染色体载体法（YAC） 利用酵母人工染色体(ＹＡＣ)作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体是近年来发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基的大片段ＤＮＡ。 　　 6、体细胞核移植法 将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。 7.其它方法… … 性腺转基因方法  总结：转基因动物的制作方法 1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3、逆转录病毒感染法 4、精子载体法 5、 YAC法 6、体细胞核移植法 显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它 基因打靶 二、培育转基因动物的方法 基因打靶 利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。 1、基因敲除（gene knock out） 2、基因替换（gene knock in） 基因敲除（gene knock out），指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中,而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因动物。 基因替换（gene knock in），指外源DNA与受体基因组中特定的内源基因发生同源重组而相关的两个内源基因中的一个基因的编码区被另一个基因的编码区的拷贝所置换的基因动物。 基因打靶 基因敲除（gene knock out）将基因组特定内源基因定点突变 基因替换（ gene knock in）将基因组特定内源基因进行定向重组 显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它 基因打靶 二、培育转基因动物的方法 三、 转基因动物的检测 DNA的提取 PCR/RT-PCR Southern杂交 表达产物的检测（蛋白/下游产物） 　　 Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 1、改良动物品种 2、生物制药 3、动物模型 4、异体器官移植 5、基因治疗 四、转基因动物的应用 转基因动物的低效性 转入基因造成宿主基因突变问题 转入基因的表达问题 病毒转基因研究存在的问题 转基因动物模型与预期不符问题 乳腺生物反应器的问题 社会问题 五、转基因动物研究存在的问题 六、细胞转染常用方法 1. 电穿孔法实现外源基因的转移 利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。 2. 磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术 这种方法是受二价金属离子能促进细胞菌吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。 不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差,有些细胞不适用 3. 脂质载体法 将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细