实验二 食品中大肠菌群的检验.ppt

实验步骤及操作要点： 1）无菌取样并制作梯度稀释液； 2）样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 4）初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 LST结果判断 大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。 5）复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。 表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 第二法：大肠菌群平板计数法 需要用到的培养基 （1）VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂 成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g～18g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.1 1）样品的稀释：如第一法 2） 平板计数 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 3）及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 实验步骤及操作要点： 4）平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。 5）证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 6）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。 例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。 三 大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法 四、美国FDA标准方法 ——行业标准采用两步法： 用于对出口食品中大肠菌群进行检验 推测试验 证实试验 样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中，36±1℃培养48±2h ，观察是否产气。 以BGLB产气为阳性，查MPN表，报告每ml（g）样品中大肠菌群的MPN值。 思考题 1．三步法大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？ 2．在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？ 3．造成本实验误差的主要原因有哪些？ 实验二 食品中大肠菌群的检验 一、实验目的 1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。 2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。 二、基本原理 大肠菌群系指一群在32～37℃下24hr内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 食品中大肠杆菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（MPN）来表示，据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，为报告