康为世纪协和基础所120809.ppt

* Western Blot HRP（辣根过氧化酶) AP（碱性磷酸酶） 大小 40Kd 140Kd 最佳酶活性 PH：5－7 PH：8－10 酶活和二抗特异性 好于AP 抑制剂 氰化物 硫化物 叠氮钠 氰化物 砷酸盐，有机磷 二价阳离子螯合剂 稳定性 零度以下稳定 零度以下不稳定 底物 很多 部分 动力学特性 快速 慢 价格 便宜 昂贵 发光底物 ECL 显色底物 TMB，CN，DAB NBT，BCIP，NBT/BCIP 两种常用检测酶系统的比较 * Western Blot 第五步检测方法 化学显色法 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离 检测 * Western Blot 康为世纪化学发光底物特点 高灵敏度：比显色法高103-106倍 灵敏度选择（普通型10-11g,增强型pg级别） 节约抗体:其它底物用量1/10－1/1000 强信号，长发光，8－24小时 底物稳定，常温保存 检测快速：1-5分钟 高特异性，高信/噪比 检测方便： X光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度 * Western Blot 灵敏度更高的ECL试剂 灵敏度一般的ECL试剂 实验条件：二抗，羊抗鼠1：10，000，室温孵育1h，曝光时间 5min * Western Blot 化学发光底物选择原则 样品丰度 检测灵敏度 WB常见问题分析 Western Blot * Western Blot 常见问题 比较均一的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快 * Western Blot 原因： 解决办法 抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗浓度 漂洗不完全 增加漂洗时间和缓冲液体积 漂洗液中加入Tween-20；浓度0.05％ 封闭液不适合 比较尝试不同的封闭液 封闭不完全 封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4℃过夜） 一、 比较均一的高背景 * Western Blot 原因： 解决办法 抗体与其它蛋白质交叉反应 更换不同的封闭液；勿在Biotin/avidin体系中使用脱脂奶粉封闭 降低二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 曝光时间太长 缩短曝光时间 膜的问题 使用干净镊子；戴手套操作 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 缓冲液污染 使用新缓冲液 过滤缓冲液 比较均一的高背景－续表 * Western Blot 二、 信号弱或者无信号 原因： 解决办法 转膜不完全 1.转膜后，确定转膜效率 2.保证转膜时胶与膜充分结合 3.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配 4.根据说明书，对膜进行处理如湿润 5.电转时防止过热 6.使用阳性对照或预染Marker 7.优化转移时间和电流 8.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇） 蛋白质与膜结合不充分 加20％甲醇于转膜缓冲液； 低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜 抗体 增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性 抗原不足 增加上样量 * Western Blot 抗原被封闭液遮蔽 试用不同的封闭液 优化封闭液中蛋白质浓度 缩短封闭时间 缓冲液里有叠氮钠 去掉叠氮钠 曝光时间太短 延长曝光时间 底物孵育时间太短 5分钟 膜的选择错误 注意膜的质量 底物丧失活性 避免使用超过有效期的底物试剂 膜上蛋白质被消化（gelatin) 封闭物质可能有蛋白质降解活性 蛋白质在储存过程中降解 重新制备样品 信号弱或者无信号－续表 * Western Blot 三、 非特异性条带 原因： 解决办法： 底物太灵敏 选择合适的底物 二抗质量差 选择质量好的二抗 交叉反应 选择单克隆抗体 抗原浓度太高 降低抗原浓度 抗体浓度太高 降低抗体浓度 曝光时间太长 减少曝光时间 * * Western Blot 四、 信号下降太快 原因： 解决办法： 抗体浓度太高 1.降低抗体浓度，特别是二抗浓度 ECL 选择 选择灵敏度稍低的ECL * * Western Blot 推荐 对照设置 内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH 阳性对照 检测一抗是否正常 阴性对照