微生物 显微镜和显微技术 课件.ppt

普通光学显微镜的几个基本概念 2、暗视野显微镜 3、相差显微镜 基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 4 原子力显微镜 （1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。 （2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。 （3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。 1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检 2）、革兰氏染色法：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察 （二）、电子显微镜的制样 样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀，提高在电镜下的反差。 作 业 1、透射电镜样品制备的方法有哪些？各自的适用范围有什么不同？ （一）光学显微镜制样 活体观察 染色 压滴法 悬滴法 菌丝埋片法 活菌 死菌 美蓝染色 简单染色 鉴别染色 革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色 二、显微观察样品的制备 光学显微镜样品制备－－活体观察 特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 用途：微生物的细致形态和结构 染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定 光学显微样品制备－－染色观察 ※1、透射电镜的样品制备 负染技术 投影技术 超薄切片技术 冰冻蚀刻技术 负 染 法 将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。 一般是采用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反映样品的内部结构。 负染法原理 负染色法观察的鞭毛 用途：可以观察细菌细胞、病毒等。 在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体形状、高度。 投 影 法 投影法观察的噬菌体 用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒 这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。 样品固定→脱水→包埋→切片。 只有在20—100纳米厚度的切片用透射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。 超 薄 切 片 法 超薄切片法观察的一种厌氧弧菌 样品-196℃迅速冷冻→加温到-100℃→切割样品→升华(真空)掉断口处的冰→重金属喷镀断口表面→电子显微镜观察 冰冻蚀刻法 冰冻蚀刻法制备的酵母菌内部结构图 优点:可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。  2、、扫描电镜样品的制备 样品先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。 扫描电子显微镜拍的葡萄球菌的表面 人类血细胞SEM照片 Condenser:聚光器 Stage:载玻片 Objective Lense:物镜 * * §2 显微镜和显微技术 借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。　　 显微镜的种类和原理 显微观察样品的制备 一、显微镜的种类和原理　　 (一)、光学显微镜 普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2μm。 1、普通光学显微镜 由三部分构成 ①照明系统：包括光源和聚光器； ②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成； ③机械装置：用于固定材料和观察方便 油镜使用 光镜使用方法 原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 适用范围：生活细菌运动性观察。 特点:只能看到物体的存在与运动,不能辨清其微细结构。 暗视野显微镜的使用 相差显微镜使用 微分干涉差显微镜DIC显微镜下的硅藻形态 适用范围：对透明的活体进行直接观察 4、荧光显微镜 原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长较长的可见光，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体 绿色：铜绿假单胞菌 黄色：蜡样芽孢杆菌 绿色：微管 红色：微丝 蓝色：核 1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。 用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍，分辨的最小极限达0.2纳米。 （二）电子显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 1、透射电子显微镜 目前TEM的分辨力可达0.2nm。 用电子束作光源，用电磁场作透镜。用于电镜的标本须制