微生物学课件第2章 微生物的纯培养和显微技术.ppt

学时安排：2学时 要求： 1、掌握微生物的分离和培养技术 2、了解显微镜和显微技术 一、无菌技术 概述 （1）培养物：微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。 （2）纯培养物和纯培养的概念：微生物学中，将由一个细胞（或一种微生物）繁殖所得到的后代称为纯培养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培养。 （3）无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿都要灭菌 培养基：培养微生物营养物质。也要灭菌 常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌 接种：在无菌条件下，用接种环把微生物从一个器皿转接到另一个器皿，叫做接种。 接种方法：烧环—冷却—开管—沾菌和塞管—开另管—涂菌—塞另一管—火焰烧环 （视频） 二、用固体培养基分离纯培养 菌落（CFU)的概念：由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体叫菌落。 菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜色及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。 菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状，这就是菌苔。 平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平皿 在自然界中，各种各样的微生物总是混杂在一起的，要研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微生物分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种微生物。这种方法叫纯种微生物的分离 涂布平板法 稀释到平板法 平板划线分离法 稀释插管法 三、用液体培养基分离纯培养 稀释法：适用于原生动物和藻类的分离和培养 四、单细胞分离 显微分离法——单细胞分离法 用毛细管提取单个原生动物个体 用显微操作仪分离单个细菌 五、选择培养分离 选择培养分离：根据微生物的营养、生理、生长条件等特点，通过选择培养进行微生物的分离与纯化技术称为选择培养分离。 用选择培养基进行直接分离 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制非需要菌的生长，促进需要菌的生长，这种培养基叫选择培养基。 高氏一号培养基加10%酚数滴，抑制其它菌的生长，分离出放线菌 马丁氏培养基加链霉素以抑制其它菌生长，分离出真菌。 富集培养 根据不同微生物间特点制定特定的环境条件，使需要的微生物生长旺盛，数量增加。 加富培养基：一般指在培养基内加入额外的营养物质，使需要的微生物营养更充分，生长的更快，这种培养基叫加富培养基。 土悬液—培养基+硫磺—分离出硫杆菌 土悬液—以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基——分离出能降解羟基苯甲酸的微生物。 六、二元培养物 纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。 二元培养物:只含有二种微生物的培养物叫做二元培养物。 例如寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。 七、微生物的保藏技术 菌种保藏目的 给微生物一特定的条件，使其不污染、不改变特性而存活下来。 菌种保藏原理 用人工方法降低微生物的代谢强度，限制微生物的生长和繁殖，使其处于休眠状态。 菌种保藏方法 传代培养保藏——隔绝空气低温保藏 冷冻保藏——保护剂+菌种——零下196度速冻保存，或-70度冷冻室保存，-20~-30度普通冰箱冷冻室保存。 干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥保藏法 纸片保藏法、薄脉保藏法、寄主保藏法等 第二节  显微镜和显微技术 决定显微观察效果的两个重要因素： 分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力 反差：指样品区别于背景的程度 一、显微镜的种类及原理 普通光学显微镜 光学显微镜的分辨率(最小分辨距)： D=0.5λ/n sinθ 式中λ为光源波长； n为玻片到物镜介质的折射率； θ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。 n sniθ叫作数值孔径。不同介质的折射率：空气为n=1.0 ；水n=1.33；香柏油n=1.55。因此，油镜的分辨率高。 暗视野显微镜 暗视野显微镜利用特殊聚光器实现给样品斜射照明，由样品反射或折射的光再进入物镜，这样整个视野是暗的，只有样品是明亮的。主要用于观察生活细菌的运动性。 相差显微镜 当光线通过标本时，由于直射光和衍射光的光程不同，就会是光波相位发生改变而产生相位差。相差显微镜具有环状光阑和相差板，能将光相位差转变为人的肉眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来的透明物体表现出明显的明暗差异。对比度增强。因此可以在不染色的情况下，观察到细胞的细微结构。 荧光显微镜 荧光：荧光素吸收紫外线会转放出可见光，这就是荧光 荧光显微技术：把标本用不同的荧光素作标记，在荧光显微