石蜡切片llp.ppt

——石蜡制片法 植物显微制片技术 石蜡切片是显微技术上最重要也是最常用的一种方法，它能切成极薄（8~10μm）而连续的切片，一般植物的根、茎、叶、子房等都可以用石蜡切片方法制片观察（特别坚硬的部分需经过特殊的软化处）理）。 一、实验原理（见纸） 石蜡制片的优点： 易操作 可以把材料切成均匀、极薄（1~12μm）的切片 可以作连续切片便于观察 可永久保存 石蜡制片的应用： 研究植物的发育，如领春木，楸树的大小孢子发育，双受精过程，胚的发育等。 植物器官和组织的结构如根，子房和胚珠结构 组织化学 RNA原位杂交 组织切片原位PCR 二、实验用品 1、器材 解剖刀 解剖针 解剖剪 镊子 不带针头的50ml注射器 恒温箱 酒精灯 吸管 切片机 载玻片 盖玻片 染色缸 树胶 显微镜 2、试剂 福尔马林-酒精-醋酸混合固定液（简称：FAA，18：1:1） 各级酒精（30% 50% 70% 80% 90% 95% 纯酒精） 蒸馏水 纯二甲苯 1%番红 0.1%固绿 3、材料 植物叶 三、实验步骤 1、取材 取健康、正常、有代表性新鲜叶3个（大小一般不超过0.5-1cm2为宜） 2、固定 将所取材料迅速投入（FAA）固定液加以固定，以免失去原形。固定24h左右。贴好标签。固定液的种类很多，按材料的性质及制片目的而定。一般原则是要求尽快杀死细胞并固定。FAA为常用固定液，可不必洗涤，直接进行70%酒精脱水。 （为尽快使固定液渗入材料，在固定液中要进行抽气处理。） 3、脱水 脱水一般使用酒精，渐次脱去组织中水分，防止材料急剧收缩而发生变形。一般从50%酒精——70%酒精——85%酒精——95%酒精——100%酒精，每一级间隔时间1~2小时。脱水这步是制片中的一个关键，如果脱水不彻底，石蜡就不可能浸好切片，切片过程中就会发生破碎现象。酒精用量为材料的3-5倍。脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。 4、透明 材料从纯酒精中出来后要经过1/2二甲苯+1/2纯酒精混合液1小时，然后转入纯二甲苯中透明。（二甲苯为挥发性的有毒物质，所以要严格在通风橱中操作，且用完的含有二甲苯的液体需回收处理） 5、浸蜡 浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中，然后再以石蜡完全代替透明剂进入材料的组织中。 常规方法是：将盛有材料的小杯中放入少量二甲苯，并加些事先刮好的蜡屑，再将小杯放入38℃左右的温箱中过夜，第二天将材料换入纯液蜡中，以后每隔3小时换一次纯液蜡。总共换3次。 6、包埋 将融化的石蜡连同材料一并倾入小纸盒中，用热针迅速将材料排齐，然后平放在冷水中使其凝固，动作一定要迅速，否则石蜡凝慢了会出现结晶，切片易碎。 7、切片 切片具体步骤见纸上。切片厚度为8μm。要得到好的连续切片需掌握以下几点： a. 刀要锋利 b.刀和蜡块的位置要调整好 8、粘片 用梅式蛋白贴剂粘片（鸡蛋清和甘油1:1混合） 注意载玻片一定要干净，粘贴剂涂的要适量（不要太多），且蜡片的背面（光滑面）和载玻片相贴。 9、染色 粘贴好的切片经1-数天干燥后再进行脱蜡、复水、染色、脱水、透明封片等步骤。 以番红—固绿对染为例说明染色程序： 石蜡切片——二甲苯脱蜡（10min）——1/2二甲苯中脱蜡（5min）——100%AlC（2min）——95%AlC（2min）——85%AlC（2min）——75%AlC（2min）——50%AlC（2min）——蒸馏（2min）——1%番红（30min或更长）——蒸馏水——50%AlC（1min）——75%AlC（1min）——85%AlC（1min）——95%AlC（1min）——0.1%或0.5固绿染液（10-40s）——95%AlC（1min）——100%AlC（2min）——1/2二甲苯（2min）——二甲苯（5min） ——中性树胶封片。 具体流程及时间安排 3人一组，共5组，一个大队长，5个小组长。 大队长负责实验的安全及时间安排，督促小组做完实验。小组长负责实验细则。 实验分两阶段完成。第一阶段：取材固定、脱水、包埋。第二阶段切片，染色，观察。预计时间两周完成。 第一阶段： 第一天上午9点取新鲜叶片，并抽气，固定在FAA中，24h左右。（此期间空余时间做准备实验，刮蜡屑，熬蜡。蜡屑尽量细小，以便渗入到组织当中，由小组成员完成。熬蜡由大队长完成，此过程要特别注意实验安全，蜡的着火点低） 第二天，上午9点开始脱水，将材料依次转入不同浓度的酒精中，梯度脱水，从低浓度到高浓度。材料用小青霉素瓶装。在逐级脱水的过程中动作迅速，避免潮湿的空气进入到材料中。以下步骤均要盖盖子。 70%酒精（1h, 9:00am——10:am） 85%酒精（1h, 10:00a