流式细胞术及其应用--生化药理转业相关.ppt

流式细胞术及其应用 第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点 流式细胞发展史 1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞。 1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动数器。 同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。 1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细胞成分；二是结合测量值对细胞分类。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法。 流式细胞发展史 1969年，Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM（即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明第一台荧光检测细胞计。 1972年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。 从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善，而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今，流式细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域，并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。 流式细胞仪及其工作原理 FACSCalibur BD LSR FACS Vantage DiVa FACSAria 本校FACSCalibur 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞(DC)研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究(MDR)、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 细胞分选系统 细胞分选系统 样品分选原理 流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。 稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。 一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f = v / 4.5 d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。 使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选 150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的， 信号检测 信号检测--荧光信号 荧光及发光原理 荧光的产生 一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。 荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。 可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术