第2章 细胞破碎技术.ppt

间接计数法 方法：样本离心 --- 取上清液 --- 测特蛋白质或酶 --- 与理论的最大值比较。 计算： Rm：理论最大值，R：实验测得值。 优点： A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶 B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。 缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。 解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。 第三节 包涵体 概念:包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。 分离:要包涵体中分离出具有生物活性的产物，通常的处理步骤为：收集菌体细胞→细胞破碎→离心分离→包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白的复性。 一、包涵体的形成、分离及洗涤 形成包涵体的因素主要有以下几个方面： 重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来； 由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小； 重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成包涵体； 重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀； 与重组蛋白的本身的溶解性有关； 在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体形成。 由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因此需破碎细胞，再经离心分离得到包涵体。 离心分离的包涵体沉淀物中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎片等，达到纯化包涵体的目的。洗涤多采用较温和的表面活性剂（如TritonX-100）或低浓度的弱变性剂（如尿素）等。洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生溶解。 二、包涵体的变性溶解 包涵体中不溶性的活性蛋白产物必须溶解到液相中，才能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性的方法才能使其形成可溶性的形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（SDS）、尿素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pH＞9.0的碱溶液或盐酸胍等。 对于含有半胱氨酸的蛋白质，其包涵体形式通常含有链间形成错配的无活性的二硫键，因此还要加入还原剂使二硫键处于可逆断裂状态。常用的还原剂有二巯基乙醇（2-ME）、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱胺酸等。 三、蛋白质的复性 复性是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。 复性的方法： 稀释复性、透析复性、超滤复性、层析柱复性、膨胀床吸附复性、温度跳跃式复性、双水相法、反胶团法 影响复性的因素： 变性蛋白的情况、蛋白质的复性浓度、 pH值、氧化还原电势、添加剂 、杂质的含量、变性剂移除（或稀释）速度、复性时间、温度、前体肽。 例：人?-干扰素的后处理工艺 发酵液 离心获菌体(发酵液冷却至10?C以下，4000r/min离心10min) 菌体 细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超声破碎5次, 5s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1%温和表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100，1000r/min离心20min，重复三次) 包含体 提取变性 (包含体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM 乙二胺四乙酸EDTA, 10mM二硫基苏糖醇DTT，室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min) 变性液 稀释复性(取1份变性液+99份上述buffer，不含二硫基苏糖醇，尿素浓度小于0.1M，4?C搅拌24h） 复性液 浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min) 浓缩上清液 Sephacryl s-200葡聚糖凝胶柱层析分离 丙烯葡聚糖凝胶层析柱2?100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱 收集主峰、冻干、终产物 (纯度可达100%，DNA及热源合格) 第二章 细胞破碎技术  第一节 细胞壁的结构与组成 第二节 细胞壁的破碎 第三节 包含体 学习目标 ①了解细胞的结构和化学组成；了解包含体的形成过程； ②理解各种细胞破碎方法及蛋白质复性的基本原理，能够应用有关方法进行细胞破碎； ③掌握常用的包含体分离技术。 微生物生产化学物质可分为两类： 胞外型 胞内型:基因工程菌产生的多数生理