第7章 蛋白质分离纯化.ppt

第七章蛋白质的分离纯化与表征 蛋白质的分离纯化与表征 蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子的大小与形状 蛋白质胶体与沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离纯化的方法 蛋白质含量测定与纯度鉴定 蛋白质的酸碱性质 蛋白质中可解离的基团 蛋白质的等电点 蛋白质中可解离的基团 蛋白质中可解离的基团 蛋白质中可解离的基团 蛋白质中可解离的基团 蛋白质的等电点 蛋白质分子的大小与形状 根据化学组成测相对分子量 渗透压法测相对分子量 扩散系数法测相对分子量 沉降分析法测相对分子量 凝胶过滤法测相对分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量 根据化学组成测相对分子量 肌红蛋白（Mb） M.W.=(Fe原子量)/(Mb中Fe含量)*100 =55.8/0.335*100=16 700 血红蛋白（Hb） 一分子中含有4个Fe原子，因此： MW=4*16700=66 800 渗透压法测相对分子量 ?=RT( + K*c2) 扩散系数法测相对分子量 Fick第一扩散定律： 扩散系数D求法（ Fick第二扩散定律） 扩散系数法测相对分子量 扩散系数D随蛋白质Mr的增加而降低。 蛋白质 Mr 扩散系数（107cm2s-1) 核糖核酸酶A 12 600 11.9 细胞色素c 13 370 11.4 肌红蛋白 16 900 11.3 凝乳蛋白酶原 23 240 9.5 血红蛋白 64 500 6.9 过氧化氢酶 247 500 4.1 肌球蛋白 524 800 1.1 沉降分析法测相对分子量 蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降速率与蛋白质分子的大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。 沉降分析法测相对分子量 斯维得贝格方程： 凝胶过滤法测相对分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量 电泳时的迁移率取决于蛋白的净电荷、分子大小、形状； SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使全部呈负电荷，同时改变蛋白质单体分子构象成近似球形；巯基乙醇打开二硫键，使亚基分离； 电泳时蛋白质向正极移动。 分连续和不连续体系（圆盘电泳） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量 蛋白质胶体性质 蛋白质的沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质的分离纯化方法 透析与超过滤 透析 通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析。因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技术和方法进一步纯化和鉴定。 超 滤 超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理分离方法。 离心技术 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。 差速离心 密度梯度（区带）离心 密度梯度（区带）离心 凝胶过滤 凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。 当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。 分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 凝胶过滤（分子排阻层析） 利用溶解度差别的纯化 利用溶解度差别的纯化 利用电荷差别的纯化