第10章离心技术.ppt

（三）等密度离心法 概念： 离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置。该离心方法称等密度离心法。 特点： （1）加样位置不拘。 （2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间影响。 （3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。 （4）分离依据是颗粒组分间密度的差异，与颗粒大小，形状无关。 （5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。 Percoll 非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬细胞 疼痛和帕金森病，体外无增殖能力，只能依赖于肾上腺髓质的分离来获取。 实验动物年龄在1 岁左右的健康小公牛，体重约200～ 400 kg, 取小公牛肾上腺，D-Hank’s 溶液冲洗后，肾上腺充分消化后剥除皮质，将髓质剪碎成1 mm左右的小块，滴加少量DHank’s液以保持髓质的营养，将滤过的细胞悬液在100 × g 下离心8min， 将细胞悬液离心后与密度为1. 090 g / ml 的Percoll 溶液混合，加入离心管底部，在其上分别缓慢加入密度为1. 064 g / ml、1.034 g / ml、1.019 g / ml 的Percoll 溶液，室温下离心，200 × g，20min。收集介于密度为1.064 g / ml 与1.034 g / ml 的两层Percoll溶液界面之间的细胞，加入D-Hank’s 液混悬后，在100 × g 下离心洗涤2 次，每次8 min。得细胞。 五、密度梯度技术 （一）密度梯度的作用: 1.增加分离层次，提高分辨率。 2.防止温差及振动造成的影响。 （二）对密度梯度的基本要求 1 梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。 2 理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，粘度小。 3 具某种可测性（如折射率）以测其浓度（密度），但不干扰分离组分的测定。 4 便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。 (三)密度梯度的设计 1.梯度介质的选用: (1)盐梯度介质 (2)小分子有机物如蔗糖 (3)三碘化苯衍生物 (4)有机高聚物 (5)胶态二氧化硅 六 :常见的密度梯度材料及应用 ⑴蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 ⑶氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 ⑷卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离其高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 ⑸Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。 2.梯度的密度范围 3.梯度的形状 4.梯度的容量 5.线性梯度的斜率 (结合离子交换的条件研究) （二）梯度的制备 1.手工制备法 2.梯度混合仪制备法 3.离心形成法 4.反复冻融法 离心操作 （一）加样和离心 样品 准备加样 离心 （二）梯度的取出与收集 取代法、穿刺法、切割法、虹吸法。 C:梯度分析: 测定梯度浓度意义 梯度测定法 样品测定 E:离心制备的步骤: 组织---匀浆---过滤---分级离心----梯度离心 F:制备超离心注意事项: 注意平衡 查阅目的物信息 第三节 分析型超速离心法 与制备用机型的不同点： 1．由于盛液器（离心池）有“光学窗口”，故受材料强度限制，允许转速略低，在80000r.p.m以内使用。 2．转速与温度直接影响测定数据，必须控制很严：转速偏差±1.5‰，温差±0.1℃ 3．附有动态光学检测，数据分析系统。 分析超离心的方法 分为沉降速度法和沉降平衡法.