第五章 动物细胞冷冻与保存.ppt

第五章 动物细胞冷冻与保存 一、冻存细胞的意义 二、细胞冷冻保存的原理 1. 冷冻对细胞器的影响（p168） （1）生物膜：通透性改变；膜蛋白被释放，并伴有酶的释放和失活；膜脂由液晶态排列转为凝胶态排列。 （2）线粒体：不能进行正常的物质代谢，得不到正常的能量供应。 （3）对酶的影响：酶失活 2. 冷冻过程中的细胞损伤机理 （1）化学损伤——溶质效应：指细胞降温过程中，细胞外部溶液中的水先结冰，细胞内的水渗出，使细胞内形成高渗环境，若降温速度太慢，细胞长期处于高渗环境会使细胞膜脂质分子受到损伤而渗漏，复温时水分大量渗入胞内使细胞死亡。 （2）物理损伤——冰晶损伤：指细胞内水分随着温度的下降而形成冰晶，对细胞膜和其他细胞器产生不可逆的机械性损伤的过程。 （3）细胞的温度休克——低温损伤：一些动物细胞如猪的卵子和胚胎，由于细胞质内脂肪颗粒含量的不同，在10～20℃情况下就可受到损伤。 （4）冷冻使细胞正常功能破坏。 3. 保护机理 （1）溶质效应可通过快速冷冻，缩短胞内高渗状态持续的时间，使细胞膜脂质分子的损伤降到最低。 （2）冰晶损伤则可以通过以下方式减小： ① 在冷冻前期使细胞内部充分脱水减少冰晶形成； ② 提高冷冻速率，使胞内水分在冷冻过程中快速冷冻形成玻璃化状态，不形成冰晶。 三、影响细胞冻存的因素 （一）冷冻温度 1. －80℃左右保存：细胞代谢并没有完全抑制，长期储存可发生变性变化，因此，一般保存期不应超过2年。 2. 液氮保存（－196℃）：可长期保存。 （二）细胞的冷冻速率 冷冻速率太慢，虽然能使胞内水分充分脱出，有利于减少冰晶形成，但同时也会使细胞严重脱水而失去活性。 冷冻速率快时，细胞内水分来不及外渗，在冷冻过程形成冰晶对细胞造成物理损伤。 冷冻速率非常快时，会使胞内水分形成无规则排列玻璃化状态，避免大的冰晶形成。超快速冷冻是最为理想的冷冻方式。 玻璃化冷冻 指高浓度的冷冻保护剂在快速降温过程中，形成一种极其粘稠的、介于液体和晶体之间的“玻璃态”，而无任何形式的冰晶形成，从而避免了因结冰而导致的各种损伤。 玻璃化冷冻多在胚胎冷冻中使用。 不同种属及同一种属不同类型的细胞对冷冻的敏感性不同，所以所需冷冻速率也不同。 绝大多数细胞的冷冻致死温度在-5～-60℃，一般在-20～-40℃为致死敏感区域。 （三）复温速率 一般来说，复温速率越快越好，采用快速升温的方法使细胞吸收水分，结构不受影响而复苏。当复温速率在100℃/min以上时，对细胞的损伤最小；当复温速率在0～10℃/min时，复温到-50℃左右时，若不快速通过此温区，可引起冰的再结晶，使细胞内原有的小冰晶重新结晶为大冰晶，更加重了溶质损伤（盐害）。 方法：将冷冻细胞从液氮中取出，立即投入到37 ℃水浴锅中融化即可。 四、冷冻保护剂 1. 概念和分类 冷冻保护剂是指为了防止细胞在冷冻和解冻过程中形成冰晶造成损伤而使用的某类小分子或高分子化合物。 渗透性冷冻保护剂： DMSO、甘油、乙二醇等小分子物质 非渗透性冷冻保护剂：蔗糖、抗冻蛋白（antifreeze protein, AFP）等。 2. 冷冻保护剂作用机理 渗透性：降低冰点,延缓结冰;提高质膜通透性,使水分 快速渗出,减少冰晶形成. 非渗透性：在一定温度下，可使溶液结冰的部分缩 小，从而降低细胞内和外溶质的浓度。 DMSO是目前最常用的冷冻保护剂，常温下对细胞 毒性作用较大，而4 ℃下其毒副作用大为减弱，因此冻存 时细胞在4 ℃ 下DMSO(5%-10%)中平衡40-60分钟。 DMSO无须灭菌处理，也不适合高压灭菌或滤膜过滤。 五、冻存程序 （一）体细胞冻存过程 取对数期细胞（5×106个 /mL）→ 等体积20％DMSO/培养液，重悬 → 分装于冷冻管或安瓿瓶中（0.5-1.5mL/管）→ 封 口 → 降 温（下降温度控制在1℃ /分） 不同细胞对冻存速度要求不同。 要适当掌握温度下降速度。 原则上细胞在液氮中可贮存多年。但为了稳妥起见，冻存一年之后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。 （二）生殖细胞的冷冻保存 1．精液的冷冻保存 精液第一次稀释用不含甘油的稀释液，在1小时内降到0～5℃，之后用含甘油的稀释液进行第二次稀释，平衡数小时后冻存： （1）细管型 （2）安瓿型 （3）颗粒型 解冻：40℃解冻后维持在5~8℃输精。其危险温区0~-60℃，最显著的有害温区-15~-25℃. 2.卵母细胞的冷冻保存 （1）卵母细胞的获取 （2）卵母细胞的分级与筛选 （3）冷冻方法 ① 慢速冷冻法 用TCM-199+5%(V/V