第五章 细胞破碎20120226.ppt

细胞破碎技术 　　 生物样品的预处理 预处理是从生物样品中提取目的产品的第一个步骤. 因为生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各 种微量元素等,因此要对目标组分进行初步富集和分 离,对干扰组分进行初步去除. 预处理材料种类:各种生物反应的悬浮液,包括动物 细胞培养液、植物细胞培养液、微生物发酵液 、动 物血液 、乳液和动植物组织提取液等. 生物样品的预处理 分离对象－发酵液或细胞悬浮液特点 1）目标产物浓度普遍较底，悬浮液中大部分是水; 2）组分复杂，含有细胞，细胞碎片，蛋白质，核 酸，脂类，无机盐等多种物质； 3）由于pH ,离子强度，温度等变化因素，分离过程易造成失活和污染现象； 4）性质不稳定，随时间变化。 生物样品的预处理 因为发酵液的上述特性,所以使发酵液的过滤与分离 相当困难.在分离过程中应该作做到 1.迅速加工,缩短停留时间, 2.控制好操作温度和pH, 3.减少或避免与空气接触受污染的机会, 4.总体设计好各组分的分离顺序. 通过对发酵液进行适当的预处理, 改善其流体性能, 提高过滤与分离的速率. 主要内容 一、概 述 二、常用的细胞破碎技术 三、细胞破碎技术研究的发展方向 四、思考题 一、概 述 （一）细胞破碎的意义 （二）细胞壁的成分与结构 （三）细胞破碎过程的检测 一:概 述 微生物代谢产物大多数分泌到细胞外,如大多数小分 子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖 化酶等,称为胞外产物.但有些目的物存在于细胞内 部,如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等,称为胞 内产物.分离提取胞内产物时首先将细胞破碎,目的 是释放细胞内产物. 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身： 单细胞蛋白（SCP） 胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等 （一）细胞破碎的意义 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性药物成分都是必要的。 细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系 上游通过细胞的生理状态对细胞破碎效果产生影响；而下游则要考虑去除细胞碎片和细胞蛋白质的污染等对产品活性的影响。 细胞破碎过程中必须考虑的因素 细胞壁的坚韧程度 、目标产品的性质 、破碎的规模、方法 、费用等 . （二）细胞壁的成分与结构 细菌细胞壁 主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多层网状结构。 霉菌的细胞壁 大多由几丁质和葡聚糖构成，还含有少量蛋白质和脂类。 酵母和真菌的细胞壁 主要为葡聚糖为β-1，6葡聚糖，通过β-1，3糖苷键与D-葡萄糖第一侧链交联，也含有甘露糖和几丁质 植物细胞壁 含纤维素、半纤维素、木质素等 （三）细胞破碎过程的检测 ①革兰氏染色法 ②次甲基蓝染色法 ③测定核酸与蛋白质含量 ①革兰氏染色法 用革兰氏染色剂进行染色破壁的酵母呈粉红色，而未破壁的酵母呈兰紫色，分别计数，并采用相同的稀释度用血球记数板进行镜检记数，计算破壁率。 ②次甲基蓝染色法 取未经灭活的发酵液 0.5ｍＬ ,用 9ｇ/Ｌ的生理盐水稀释 1 0 0倍后 ,用次甲基蓝染色5ｍｉｎ ,用血球计数板计数 ,计算出细胞的存活率。 酵母存活率 ： =[1 -(染色细胞总数 /酵母细胞总数 ) ]×100 %. ③测定核酸与蛋白质含量 分别在 2 60和 2 80ｎｍ波长下 ,测定发酵液的光吸收值，用Lowry法测量细胞破碎后上清中的蛋白质含量也可以评估细胞的破碎程度，判断细胞破碎率。 核酸提取率： =[(处理后发酵液的吸光值 /未处理发酵液的吸光值 ) -1]×100% Lowry法是最为灵敏的蛋白浓度测定方法之一，是已知的被引用最多的蛋白质定量方法。加入Folin-Ciocalteu试剂试剂后，试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐在碱性条件下，易被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，呈蓝色反应。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。最后在500nm检测该颜色反应的吸光值，与标准对照计算出蛋白质的浓度。 细胞破碎机理图 机械破碎法与非机械法比较 常用的细胞破碎技术 常用的细胞破碎技术 (一)珠磨法 4.影响因素 珠磨机硬件确定后,影响因素有转速、进料速度 、珠子的直 径与用量、细胞浓度 、冷却温度等. 延长研磨时间、增加珠体的装量 、提高搅拌器转速和操作 温度等都可有效地提高细胞破碎率，但高破碎率将使能耗大 大增加．当破碎率超过80%时，将带来的问题有：产生较多 的热能，增大了冷却控温的难度；大分子目的产物的失活损 失增加；细胞碎片较小，分离碎片不易，给下一步操作带来 困难