全内反射荧光显微镜介绍.ppt

全内反射应用的核心问题 全内反射应用的核心问题是制作与电子显微术（EM）切片尺寸相当的光学切片。 共焦技术 VS.全内反射技术 共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深度分别为～500－800nm。 全内反射显微术: 典型的垂直照明深度100nm。 结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。 全内反射的应用 在生物单分子研究中的应用 直接观察细胞表面的生命活动,而不受细胞深层区域信号的干扰. 全内反射荧光显微术的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 全内反射的应用比较 与其他生物单分子研究技术的比较 全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM） 全内反射的应用比较 全内反射荧光显微镜（TIRFM） 全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。  全内反射的应用比较 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和双光子激光扫描显微镜（TPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术。 CLSM的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄层的厚度（200nm）。 TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。 生物单分子荧光检测技术的比较 共聚焦激光扫描显微（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM） 全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共同点 检测细胞荧光物质的技术——空间分辨荧光分析技术 区别点 CLSM提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。不要求高于衍射极限的分辨率 TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率。双光子激发能探索活细胞内各种分子的实时动态，能实现在样品中的高度精确定位。减少了光损伤，特别对需要条件温和的生物体系有利 TIRFM具有高度的界面（表面）特异性，可有效排除本体干扰，获取界面信息。纵向分辨力极高，特别适用于表面或界面单分子的测定。全内反射荧光法相对简单，费用低廉。表面或界面单分子的测定 展望前景 不论是对物理成像学家还是对细胞生物学家而言，全内反射荧光显微术均是一项新的技术。它的未来发展将是怎样的呢？ 它将向着两个前沿方向发展：技术上的进一步创新和在新的细胞生命科学领域中的应用。这意味着在一方面全内反射荧光显微术将继续和其它的显微成像技术，如荧光相关光谱技术，荧光寿命成像技术以及原子力显微术相结合；另一方面，继续寻求成像原理上的突破，这也正是目前有待积极探索的课题。 全内反射荧光显微镜的改进 1. 光电探测设备探测效率和探测速度的提高 新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入 2. 单分子染色技术的发展 新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入 超高的信噪比，能够得到完美的图像 崭新的UIS2物镜的信噪比优越，高于现有物镜50%。这种物镜的新特性还包括精选了低自发荧光玻璃（通过全反射镀膜和连接材料，显著减少了自发荧光），提高了数值孔径，增强了信号亮度。UIS2系统在弱激发光下，能够有效探测极弱荧光，从而建立了活细胞荧光成像的新标准。 新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入 拥有更宽波长范围内的高透过率 内置物镜采用UW多层镀膜技术，能有效消除超宽谱带上的反射，在可见光到近红外光的波长范围内能够实现平坦的高透过率，在近红外和紫外范围内的透过率显著提高。提高较宽波长范围内的性能使它非常适合当今最需要的研究用途。 新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入 有效消除直到近红外范围的色差 杰出的超级复消色差特点有效地消除了从可见光谱直到1000nm范围内的色差, 意味着从紫外到红外范围内的成像都可以只用一个物镜实现。这一系列物镜在使用覆盖很宽谱带的荧光进行多色观察时，可以获得出色的清晰图像而不产生颜色偏移。 新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入 双