上海交通大学微生物实验实验十一血清学试验.ppt

实验十一凝集试验（Agglutination assay ）酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA) 实验要求 掌握凝集试验的原理、方法，结果判定和凝集效价的判定。 掌握ELISA的基本原理，操作步骤，和ELISA的应用。 了解血清学试验在病原微生物学中的应用 一、抗原的基本概念 　　　抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与抗体和致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。 　抗原决定簇（抗原表位epitope）:抗原分子上的免疫活性区，负责和免疫活性细胞上的抗原受体和抗体相结合。有的抗原分子上可能只有一个抗原决定簇（抗生素等小分子），有的抗原分子上可能有多个抗原决定簇（如病毒、细菌等）。 用病毒或细菌等抗原免疫动物机体后，机体所产生的抗体则为多克隆抗体，即通常所讲的抗血清。 二、抗体的基本概念 　　机体在抗原物质的刺激下所形成一类与抗原特异性结合的血清活性成分为抗体（Antibody）。抗体的化学本质是免疫球蛋白。 　　所有抗体的单体都由4条多肽链构成：两条重链和两条轻链。 　轻链N端1/2和重链N端1/4的氨基酸组成和序列变化较大，称为可变区（variable region,VL,VH）,肽链的其余部分变化不大，称为恒定区（constant region,CH,CL）。可变区是与抗原结合的区域，决定抗体的特异性。 ELISA的基本原理 　　　酶标记抗体或抗原可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。在底物溶液中在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应（酶分子与抗体或抗原共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性）。 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 　　　 根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。 应用：抗原鉴定、疾病诊断、抗体效价检测、疫苗免疫效果评价等 检测抗原 检测抗体 实验步骤 １：所有试剂回升到室温 ２：标记好各自的反应孔（每组2人，每组4个孔） ３：抗体包被，４℃过夜，ＰＢＳＴ洗涤（该步骤试剂盒已完成） ４：每组第１-3孔各加5０μl样品稀释液，然后第一孔加提供的大肠杆菌菌液5０μl，然后递减稀释至第2孔，从第2孔取出50 μl丢弃。第3孔不加其他物质，第4孔加50μl阳性标准对照物, ２５℃作用30-60min． 5：倒掉孔中液体，并在吸水纸上拍干，每孔立即加洗涤液ＰＢＳＴ溶液５０μl，室温静置２分钟，拍打干净，按上述方法再重复洗涤各孔3次。 6：每孔加5０μl已稀释的酶标记物，２５℃作用30-60min 7：洗涤3次，同步骤5洗涤． 8：加显色试剂 A 5０μl,再加显色试剂 B 5０μl,25℃暗处作用１５分钟． 9：每孔加反应终止液５０μl,特别注意安全，观察颜色变化. 10: 测定在４５０nm处测定吸光度值。 所有的测试条都放回到板中统一测定以空白孔调零。 记录各孔的OD值，确定阴性和阳性值。 P/N值大于2.1为阳性 P为样本的OD值 N 为阴性对照的OD值 凝集试验的原理 细菌等颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，出现肉眼可见的凝集块，为凝集反应。 可用于快速鉴定细菌和测定抗体的效价 凝集实验的应用 细菌凝集试验步骤 取一块干净的玻片，分成2个区，并在玻片的左上角做好标记 分别吸取20μl生理盐水在第一区和第二区 无菌操作，分别挑取适量的菌落，于第一区和第二区，混匀。（或先制备成菌液，再滴加到玻片） 在第一区加入20μl阳性血清，混匀，晃动玻片观察结果。第二区没有凝集，第一区出现凝集块的判定为阳性，即细菌与所提供的抗体具有特异性结合。 实验结果 实验报告（所有的实验报告都要交） 复习做好考试的准备 确定 13周周三下午考试 ？ * * * *