FACSCalibur双色荧光检测简易操作步骤.doc

FACSCalibur双色荧光检测简易操作步骤 一、开机（见开机程序） 二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 1） 在屏幕下方点击CELLQuest（第四个图标） 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。 2） 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。 3） 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。 4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024； Y轴：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)。 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中， 横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024，X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数， Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。 5） 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。 6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。需画2个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024，另一个横坐标选择FL-2-1024； 7）在上面直方图中画出M1和M2，其中M1代表隐性数目（一般标示是101），M2代表阳性数目（除M1以外所有的部分）。 8）从Stats菜单中选择Quadrant Stats（象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。 三、建立仪器和计算机之间通讯 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer (快捷键Win+b)，此时会出现Acquisition Control 对话方框。 四、仪器设置文件 注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。 1） 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC（根据实验样品确定，一般细胞选择LIN，细菌选择LOG），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。 2）从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。 3）从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。 五、 上样品、设置仪器 使仪器处于High RUN，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中( Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据，用于仪器设置)，点击Acquire。 1、调节FSC/SSC探测器（电压） 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain 从1.00—9.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acqu