质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定.ppt

PCR相关技术 PCR相关技术 荧光定量PCR（real-time PCR） PCR相关技术 质粒提取方法 方法：碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小 大肠杆菌菌株 裂解后用于纯化的技术和实验要求 基本步骤 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 1)培养细菌使质粒扩增 2)收集和裂解细菌 3)分离、纯化质粒DNA 2、离心层析柱 质粒定量检测 紫外分光光度计法 根据在260nm以及在280nm的读数比值（ A260/280 =OD260/OD280）估计核酸的纯度 注意事项 * 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。 * * * * * * * * * * PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。  * * * 五、预期实验结果 M: DL5000 DNA Marker 1, 4,7,10 为质粒 2, 5,8,11 为PCR目的条带; 3, 6,9,12为酶切片段 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 酶切长片段 含目的DNA片段的酶切短片段 温馨提示 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。 Gelview是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有Gelview的溶液在弃置前应当进行净化处理。 一、回顾实验流程 简述实验内容流程，PCR操作步骤 ↓ 煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温） ↓约2小时收集PCR产物 学习PCR原理 ↓ 质粒DNA提取（约1小时） ↓ 紫外检测定量知识（计算方法），步骤 ↓ 紫外检测定量 ↓ 琼脂糖电泳原理 ↓ 电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker） ↓约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存 思考题 碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？ 2.简述PCR产物电泳出现非特异扩增条带的原因。 * * * * * * * * * * * * * * * 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 * 酶活力:单位U:1小时完全消化1μL DNA的酶量为1个单位 * * * 基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 * * * 载体的标准：（1）能自主复制；（2）具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；（3）有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；（4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。 * * * * 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 9000rpm×30 s，弃上清 加入250μl 溶液P1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 加入250μl 溶液P2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮（溶液P2为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 加入400μl 溶液P3，立即温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，室温放置3-5min。（溶液P3为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时使SDS-蛋白复合物沉淀），室温13000rpm离心10min，小心取上清液。 将吸附柱放于收集管中，加入500μl去蛋白液