植物天然产物在微生物体内合成的代谢工程 - 生物化学与分子生物学.ppt

植物天然产物在微生物体内合成的代谢工程 谢宏林 摘要 植物天然产物（NP）有重要的药理活性。从植物中分离天然产物（NP）常常受限于低含量，环境，季节和区域差异，而全化学合成这类具有复杂结构的物质在经济上又明显不可行。在微生物体类重建生物合成途径成为一种重要手段。为此，代谢工程为在这些经过基因工程改造的异种宿主中提高NP产量提供了技术平台。最近，包括组成生物合成，密码子优化，调控元素的表达和P450的蛋白质工程在内的一系列技术使得类异戊二烯类，苯丙类和植物碱的生产上取得了很大进步。 背景介绍 植物NP在药物开发中有着非常大的应用潜力，生物制药进入一阶段测试的有25%的几率通过最终监管部门的许可，而传统的药物生产方法只有6%的通过几率 。 NP的全化学合成 NP的生物活性和药效主要起源于它们复杂的结构，包括区域特异功能化和手性。因此，全化学合成使化学家面临很多挑战 ，即使能成功，所涉及到的大量的步骤会导致非常低的总产率。如紫杉醇 ，其产率只有0.02%。 NP的植物提取 植物NP一般以很低的量积累并且需要很长的生长时间。 需要从具有相似结构的多种混合物中纯化所需要的组分，而且产物又受限于地域性和环境因素。 植物细胞培养能够标准化产量波动的问题但面临的挑战包括漫长的倍增时间和繁琐的分离步骤。 微生物发酵生产NP 菌株随时可以从实验室规模的发酵发展的工业化的大规模发酵 。 倍增时间，生产周期短 ，成本低 （C、N源）。 重组微生物是典型的没有竞争途径的转基因代谢，于是生产出特异性的对映体不同的产物和中间代谢产物，这些通常会使下游提取缩减到一步 。 发酵生产NP的技术手段及所面临的挑战 宏基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表型学都是鉴定一个植物NP合成路径相关的基因、酶和代谢物的重要手段。 一旦一个异源的路径被导入到微生物宿主内，接下来的挑战便是提升产量使得它成为一个商业上切实可行的平台。 代谢工程是用来解决NP异源生产第二个限制因数的平台技术，即通过基因工程等一系列手段优化目的产物的生产。 类异戊二烯的生物合成工程 类异戊二烯（也被称为类萜）代表了最大的一类已知的植物代谢产物，包括类胡萝卜素和固醇，最出名的就是紫杉醇、番茄红素和青蒿素。所有的类异戊二烯起源于普通的五碳骨架结构，异戊二磷酸（IPP）和它的异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMPP），它们或起源于甲羟戊酸途径（MEV）或起源于甲基磷酸赤藓糖醇（MEP）途径，因机体不同而不同。 紫杉醇 紫杉醇在短叶红豆杉中产生，已经被批准用来治疗难治性卵巢癌和转移性乳腺癌。 它的生产是基于将来自不同种类的紫杉醇的针叶或细胞培养物的紫杉醇中间体用化学转变为紫杉醇的半合成方法。然而，建立一个强有力的生物合成路径的需求仍然存在，以满足日益增长的需求。 青蒿素 青蒿素是一种从青蒿中分离出来的抗疟药物，它对对多种药物合并使用抵抗的恶性疟原虫菌株有很好的效果。 一种从青蒿酸开始的半合成路径有可能会成为有效的方法，而青蒿酸可以由经基因工程改造的微生物中获得 。 番茄红素 类胡萝卜素是类异戊二烯的一个亚家族，是由细菌、水藻和真菌合成的天然色素，主要分为黄色、橙色和红色。商业化了的类胡萝卜素，如番茄红素、β胡萝卜素和虾青素被用作食品着色剂、动物饲料添加剂、营养和美容的目的。最近，类胡萝卜素由于其显著的抗氧化活性和在抑制慢性疾病发病中发挥重要作用而受到关注。 苯丙素生物合成工程 苯丙类化合物是一类多元化的植物次级代谢产物。苯丙类化合物（包括类黄酮和芪）拥有非凡的抗氧化活性、雌性激素活性、抗病毒、抗菌和抗癌活性。 类黄酮对保护健康的作用刺激了对它生物合成网路阐明的研究和构建基因工程宿主平台来进行生产的研究。 类黄酮 大肠杆菌和酿酒酵母都被用于重组类黄酮路径的代谢工程。苯丙途径最初的几个步骤需要在酵母中表达苯丙氨酸转氨酶和肉桂4-羟化酶来首先使苯丙氨酸脱氨形成肉桂酸，然后经过羟化形成对香豆酸（具体代谢途径见图）。据报道黄烷酮的产量被进一步提高了通过用致死剂量的浅蓝菌素抗生素来阻断脂肪酸的生物合成 。 芪（二苯乙烯） 芪是另一类获得重视的苯丙类化合物，特别是特别是白藜芦醇，抗氧化剂和能通过激活siruin脱乙酰基酶来延长酵母、果蝇、线虫和鱼的寿命。据报道，在酿酒酵母中利用内源性的苯丙氨酸生产出了白藜芦醇。 生物碱生物合成的代谢工程 生物碱是低分子量含氮化合物，有着重要的药用价值如作为镇痛剂、兴奋剂和化疗药物。 由于其广泛的应用，其合成平台已经被构建，主要建立在植物细胞和组织培养的基础上。在过去，烟草、天