DNA 合成实验室的建立.ppt

建立DNA合成平台所需要的仪器及试剂耗材 一般要求 DNA 合成部分 DNA 合成后处理部分 寡核苷酸纯化部分 寡核苷酸检测部分 一， 一般要求 建立oligo 寡核苷酸合成实验室一般原则如下。 1， 房间：一般情况下，需要5个房间或将房间分割为7个独立工作区域，房间要求通风状态良好。 1.1 合成间用于寡核苷酸的合成，包括合成柱装填及合成。 1.2 氨解间（区域）：用于合成产物的氨解及浓缩。 1.3 纯化间（区域） ：合成产物的纯化，纯化方式为固相萃取，HPLC及电泳。电泳所需面积较大。 1.4 纯度检测间（区域） ：用于测定合成产物的纯度。 1.5 定标及打印间：用于测定合成产物的OD值，分装，打印标签，贴标。 1.6 办公室 1.7 试剂准备间（区域）：如需自行配制试剂，可选择手套箱。 2，人员：3-4人 3，合成管理：推荐使用专业实验室管理软件，内容应包含试剂管理，客户管理，订单管理等内容。 二， DNA 合成部分 最好使用独立房间，请注意温度和湿度。 1， 仪器 DNA 合成仪，空调，除湿机，真空干燥箱（oven），UPS稳压电源，层流柜或通风橱，气瓶，计算机等。 ——除DNA 合成仪外，其它均可由用户自备。—— 环境要求：干燥，实验室洁净，明亮，最好是净化实验室，但不可直晒。 温度要求：室温。 供气系统：高纯氩气或氮气（压力3个大气压）。 合成 合成 合成 合成 合成 试剂及耗材 如需自行配制试剂，可单独划定区域放置手套箱，不宜离合成间太远。 冷藏或冷冻保存的试剂须回复室温后使用。 2.1 DNA 合成试剂： 脱保护剂： deblocking reagent， 3%TCA/DCM或3%TCA/DCE,用于合成过程中脱去碱基中的DMT 保护基团。 活化剂：activator，包括acitvator， activator 42等，浓度一般选择0.25M，用户活化碱基单体。 盖帽试剂A，CapA，盖帽试剂B，CapB：用于封闭未参加延长反应的CPG。 氧化剂：使延长链形成稳定结构。 氧化剂，溶解用乙腈（DNA合成级，水分含量≤10ppm），用于溶解单体。 洗脱乙腈（水分含量≤30ppm） A,T,C,G 单体：在低于10 ℃条件下保存，最好冷冻保存。 CPG(controlled pore glass)载体： 手套箱 2.2 DNA 合成用耗材 注射器：20ml一次性注射器，配长针头，用于溶解碱基时吸取溶解用乙腈，使用时可在真空干燥箱（oven）中40℃干燥后使用。 滤片：用于封闭合成柱。 合成柱：有些和程序需要购买合成柱，有些合成仪无需购买合成柱。 活化分子筛，3A, 用于碱基溶液及活化剂溶液防水，乙腈脱水。 三、DNA 合成后处理部分 最好使用独立房间。 1，仪器 真空泵，离心浓缩仪（带制冷），高速离心机，移液器，水浴锅。或选用专用裂解架。 如合成产物为RNA，需配置冷冻干燥机。 2， 试剂耗材 饱和氨水（32%），0.2ml 薄壁管，1.5ml 旋盖微量离心管。 四、寡核苷酸纯化部分 合成的寡核苷酸常用的纯化方式脱盐、BioRP / OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 1， 脱盐或OPC纯化——固相萃取 正压/负压固相萃取装置，真空泵，固相萃取小柱，注射器等 加液方式可选用移液工作站，连续移液器。 OPC纯化，测OD值 2，HPLC纯化 可选用任何品牌HPLC。蠕动泵须有连续梯度功能。 进样池要求能达到1m,纯化柱可选用C18反向柱或阴离子交换柱。 （1） 仪器及配套 HPLC, 寡核苷酸纯化柱 超声波清洗器。 （2）液相色谱纯化试剂： 试剂选择原则：固体试剂为色谱纯，液体试剂为分析纯。 主要试剂：冰醋酸(glacial acetic acid)，四乙胺（TEA），如需纯化G含量较高的寡核苷酸，需六氟异丙醇（HFIP），乙腈（HPLC级），纯净水 主要耗材：量筒，移液器，枪头，抽滤装置及针筒式滤器，进样针，收集管等。 液相色谱 液相色谱 电泳 96通道毛细管电泳 五，寡核苷酸检测部分 Oligo的检测分纯度检测及含量检测。纯度检测一般采用质谱或毛细管电泳方法，也可由PAGE 方法检测。含量检测一般用分光光度计测其OD值。 毛细管电泳 质谱 打印贴标