一、发酵过程主要生化指标的测定发酵液中还原糖的测定——直接滴定法.PPT

一、发酵过程主要生化指标的测定 发酵液中还原糖的测定——直接滴定法 1、? 什么是还原糖？ 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类 。 关键在于分子中有没有游离的具有还原性的半缩醛羟基。 2、? 为什么测还原糖？ 还原糖作为重要的碳源，其浓度是控制发酵过程中的重要参数之一。随着发酵过程的进行，发酵培养液中的还原糖被菌体消耗利用，转化成菌体组织或代谢产物。因此，测知发酵过程中还原糖浓度变化，通过定时取样检测发酵液中的还原糖浓度，可以更好的了解发酵进程，以便优化控制发酵生产过程。对发酵控制和发酵终点的判断有重要的指导意义。 3.反应原理 CuSO4+NaOH Cu(OH)2 ↓ Cu(OH)2 +酒石酸钾钠 酒石酸钾钠铜络合物(Cu2+) 酒石酸钾钠铜络合物+葡萄糖 Cu2O↓+葡萄糖酸 在滴定中Cu2+完全还原后，微过量的葡萄糖也能将弱氧化剂次甲基蓝还原，使之蓝色消失，即达到反应终点 。 4.实验方法 1.空白滴定 ?精确吸取费林甲、乙液各5mL放入锥形瓶中，加蒸馏水10mL。再用滴定管加入0.1%葡萄糖标准液9mL。摇匀在电炉上加热，沸腾15s后，匀速滴入0.1%葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点。记录沸腾前后共耗用葡萄糖液毫升数(A)。 2.预备滴定 精确吸取费林甲、乙液各5mL，放入锥形瓶中，加蒸馏水10mL，再加1mL稀释样液。根据样品含糖量的高低(估计数)，可用糖液滴定管先加入一定量的0.1%葡萄糖液，摇匀加热，沸腾15S后，匀速滴入0.1%葡萄糖液，至蓝色消失即为终点，记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液毫升数，作正式滴定时参考用。 3. 正式滴定(做两个平行实验) 精确吸取费林甲、乙液各5mL，放入锥形瓶内，加蒸馏水10mL及1mL稀释样液，再用糖液滴定管加入比预备滴定耗用量少0.5mL左右的0.1%葡萄糖标准液，摇匀后加热，使其在1～2min内沸腾，沸腾15S后匀速滴入0.1%葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点，记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液的毫升数 (B)。 滴定注意事项 至少以1秒1滴的速度滴定 ； 滴定在1min内完成； 滴定消耗量葡萄糖量控制在1ml以内； 做平行测定,两次相差不得超过0.1mL。 沸腾后滴定。 滴定终点：一瞬间变成澄清的黄色溶液 样品是稀释10倍后的稀释液 快到终点时减速，摇晃三角瓶 中途不要更换试剂 5. 数据记录 6. 结果计算 按下公式进行计算： (A -B) ×C 还原糖(g/100mL)＝───────×样品稀释倍数 ???? W 式中: A——空白滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数，mL;???? B——正式滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数，mL;(取两次平行实验的平均值)???? C——葡萄糖标准液浓度(0.1g/100ml)???? W——参加反应的稀释样液量，mL。 二、发酵过程主要生化指标的测定 氨基氮测定——甲醛滴定法 为什么要测定氨基氮？ 氨基氮是微生物生长的主要氮源，菌体代谢主要氮源是由蛋白分解形成的单体氨基酸。 因此，氨基氮的含量是一项表明潜在的菌体生长和发酵力的重要指标。 三、大肠杆菌发酵种子的制备 菌种 斜面 一级种子 二级种子 按学号，4人一组，3组共用一支斜面种子 摇瓶装液量50ml 一级种子种龄在14h±2h内，二级种子7-8h内 时间安排 镜检：革兰氏染色 写上组号，上交，每组交三片，写上时间，组号。作为评分依据。 大肠杆菌是G-菌 步骤：初染、媒染、脱色、复染 1、? 涂片固定 2、? 草酸铵结晶紫染1min 3、? 自来水冲洗 4、? 加碘液覆盖涂面染1min 5、? 水洗，用吸水纸吸去水分 6、? 加95%酒精数滴，轻轻摇动脱色，30s后水洗，吸去水分。 7、? 番红染色液染1min，自来水冲洗，干燥，镜检。 阳性呈紫色，阴性呈红色。 pH 测量方法：精密pH试纸。 pH的变化理论上为： 初期，菌体生长期，菌体利用营养物质释放酸，使pH↓ 中期，生物合成期，pH相对稳定 后期，菌体自溶期，氨基氮↑，pH↑ 生物量测定——浊度法 OD测浊度： 分光光度计使用前预热20min。 在420nm处测量 为了使OD值与浓度成线性关系，应稀释，保证OD值小于0.5，把稀释倍数也记录在表格里，理论上，二级种子结束时的OD应大于一级种子。 稀释5倍或10倍甚至更多。 灭过菌的空白培养基作参比液,稀释相同倍数。 实验室安排 每组领一台显微镜，放在510 接种 502