钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定.pdfVIP

87 中国兽医杂志2016年(第52卷)第12期 O 钙激活氯通道蛋白AN1在小鼠主动脉 平滑肌细胞的表达及其功能鉴定 张委乔1，王 胜2，刘艳杰3，崔爽1，曲 适1，王鑫鑫1，龙啸4，方芳1，郝峰1 (1．吉林医药学院生物化学检验教研室，吉林吉林132013；2．吉林省肿瘤医院，吉林长春130021； 3．吉林医药学院附属医院，吉林吉林132013；4．重庆探生科技有限公司，重庆九龙坡400039) 摘要：探讨钙激活氯通道蛋白AN01在C57BL／6小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达及其功能特性。运用胶原酶消化法 mR— 获得原代培养的小鼠主动脉平滑肌细胞，流式细胞术检测平滑肌细胞纯度；应用RT—PCR检测主动脉平滑肌细胞ANOI NA的表达；免疫印迹检测AN01蛋白在主动脉平滑肌细胞的表达情况；应用荧光淬灭动力学实验检测AN01钙激活氯通道 达；免疫印迹显示主动脉平滑肌细胞蛋白水平有ANOI表达；荧光淬灭动力学实验证实表达在主动脉平滑肌细胞的ANOI 具有阴离子转运功能，即钙激活氯通道典型特性。小鼠主动脉平滑肌细胞表达的AN01是钙激活氯通道的分子基础。 关键词：AN01蛋白；钙激活氯离子通道；小鼠；主动脉平滑肌细胞 中图分类号：R337．5 文献标志码：B 高血压是心脑血管疾病的第一危险因素。血 前期构建。 管平滑肌细胞上的离子通道是血管正常收缩舒张 1．2方法 来维持血压的重要因素¨J。C1一是细胞外液主要阴 1．2．1 主动脉平滑肌细胞培养及形态学观察和鉴 离子，通过跨膜转运和阴离子通道蛋白参与多种生 定采用组织块法与胶原酶消化法联合收集主动 理功能。目前研究发现Anoctamin一1(AN01)能够 编码CaCCs_2叫J。因此以小鼠主动脉平滑肌细胞 养液于37℃、5％CO，环境下培养3d，倒置显微镜 作为研究对象，应用分子生物学、免疫荧光化学方 观察细胞形态，流式细胞术检测平滑肌细胞纯度。 法以及荧光淬灭动力学实验，明确ANOI在主动脉 平滑肌细胞的表达，为深入研究该通道功能、明确 该通道与高血压的发病机制及靶向治疗提供实验 板，逆转录为cDNA，PCR扩增。参照文献[4]合成 依据。 GTTCAG一3 7，下游5 1材料与方法 1．1 实验动物与主要试剂C57BL／6小鼠由吉林 大学第二医院实验动物中心提供。兔抗鼠Or．一平滑 3’。RT—PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。 肌肌动蛋白(仪．SMA)单克隆抗体，购自BD公司；1．2．3 免疫印迹检测AN01蛋白的表达按照 anti—AN01单克隆抗体及HRP标记羊抗兔IgG，购 BCA蛋白质定量方法测定蛋白质浓度。SDS．PAGE 自SANTA CRUZ公司；ionomycin和T16Ainh．A01， 凝胶电泳后转至PVDF膜，封闭2h，加AN01单克 LTX，购自Invitro- 购自Millipore公司；Lipofectamine 隆抗体(1：100)4℃过夜。漂洗后加入二抗(1： gen公司；pcDNA3．1．YFP—H148Q／1152L为本实验室 500)孵育1h。继续洗膜，加入底物室温孵育 1 min